魏強(qiáng)，張薇，石黑虎，李冬明，邢明振，王淑平

（根力多生物科技股份有限公司，河北 威縣 054700）

地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）中較具應(yīng)用潛力的菌種之一。其屬于革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，可產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，耐熱抗逆性強(qiáng)，在土壤和植物表面普遍存在，對人畜無毒無害，是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生菌。近年來，地衣芽孢桿菌在種植業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究日益增多[1]，研究結(jié)果主要包括：地衣芽孢桿菌對西紅柿具有明顯的促長作用[2]；地衣芽孢桿菌可以分離純化出多種抗菌物質(zhì)，主要有幾丁質(zhì)酶、抗菌蛋白、多肽類等蛋白類物質(zhì)[3]；地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生苯乙酸類的抗菌物質(zhì)[4]；地衣芽孢桿菌能夠防治煙草黑脛病[5]、番茄灰霉病[6]、棉花枯萎病、棉花黃萎病[7]、稻瘟病[8]、蘋果輪紋病和青霉病[9]、水稻紋枯病[10]、棉苗根腐病[11]和馬鈴薯晚疫病[12]。此外，地衣芽孢桿菌還可增強(qiáng)角素抑制辣椒根腐病的活性[13]，其死菌體能夠吸附重金屬[14]，對改變土壤微生物群落[15]和降低農(nóng)藥殘留[16]等也有一定的作用。

迄今為止，有關(guān)地衣芽孢桿菌的研究集中在其應(yīng)用效果上，而對其發(fā)酵生產(chǎn)的報道甚少[17]，僅有幾篇飼用菌種發(fā)酵工藝的研究報道，且僅限于實驗室搖瓶或小試階段，與工業(yè)化生產(chǎn)差距較遠(yuǎn)，農(nóng)用菌種發(fā)酵工藝的研究幾乎為零。工業(yè)化生產(chǎn)農(nóng)用地衣芽孢桿菌發(fā)酵水平低下，且在微生物肥料中農(nóng)用飼用菌種混用的實例屢見不鮮，因此，系統(tǒng)深入研究各種農(nóng)用微生物的生理生化特性，優(yōu)化發(fā)酵過程，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，顯得尤為重要。

以一株促生、防治病害、降低農(nóng)藥殘留等綜合效果較好的農(nóng)用地衣芽孢桿菌10236 為研究對象，采用單因素與正交試驗相結(jié)合的試驗方法，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并在工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行驗證應(yīng)用，旨為地衣芽孢桿菌10236 在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試菌種為地衣芽孢桿菌10236，由根力多生物科技有限公司微生物研究室提供。

培養(yǎng)基有3 種。其中，種子培養(yǎng)基成分為蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%，pH 值7.0；計數(shù)培養(yǎng)基成分為蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、瓊脂粉1.5%，pH 值7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方為酵母膏0.1%、糖蜜1.25%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、黃豆粉1%、玉米淀粉0.8%、MgSO4·7H2O 0.05%、MnSO4·H2O 0.05%、CaCO30.3%、NaCl 0.5%，pH 值7.0。

試驗碳源種類有玉米淀粉、果糖、葡萄糖、乳糖、糊精和糖蜜，共6 種；氮源種類有花生餅粉、黃豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素和酵母膏，共6 種；無機(jī)鹽種類有MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3和NaCl，共4 種。

儀器設(shè)備有RH-Q 全溫振蕩器（天津市華儀鑫達(dá)儀器儀表有限公司）、VYJ-1340A 超凈工作臺（蘇州佳運通凈化設(shè)備有限公司）、DH-600 型恒溫培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）、LDZH-150KBS 高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、JM-A5002 電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司）、PHS-3C酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、UV-1800 型紫外分可見分光光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、BM2000 顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）和HH-2 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化與培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化。將凍存的甘油管轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，直至有大量芽孢出現(xiàn)；斜面加入5 mL 無菌生理鹽水洗脫菌苔，制成混懸液，在80 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min；蘸取混懸液在斜面劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.1.2 種子液制備。取一環(huán)活化好的菌種接入100 mL 種子培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

“云南省云嶺牛種源供應(yīng)充足，已建成國家級云嶺牛核心育種場1個，擴(kuò)繁場6個，存欄純種母牛1546頭、純種公牛133頭，年供種能力達(dá)850頭以上，年可提供凍精100萬劑以上。目前，全省存欄純種云嶺牛7583頭，其中，種公牛1380頭、純種母牛6203頭?！痹颇鲜∞r(nóng)業(yè)廳負(fù)責(zé)人介紹。

1.2.1.3 搖瓶培養(yǎng)。取4 mL（接種量2%） 種子液接入200 mL 種子培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下培養(yǎng)20 h。

1.2.2 培養(yǎng)基單因素發(fā)酵條件的優(yōu)化（單因素試驗） 試驗單因素為碳源種類、氮源種類和無機(jī)鹽種類。在其他因素固定的情況下，變化某個單因素水平制成發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，碳源種類試驗為分別用2%的玉米淀粉、果糖、葡萄糖、乳糖、糊精、糖蜜代替基礎(chǔ)配方中的其他碳源，氮源種類試驗為分別用2%的花生餅粉、黃豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、酵母膏代替基礎(chǔ)配方中的其他氮源，無機(jī)鹽種類試驗為分別用0.05%的MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3、NaCl 代替基礎(chǔ)配方中的其他無機(jī)鹽，每處理3 次重復(fù)。搖瓶培養(yǎng)（方法同1.2.1.3） 后，采用稀釋平板計數(shù)法測定活菌總數(shù)；樣品80 ℃水浴恒溫處理30 min 后，采用稀釋平板計數(shù)法測定芽孢總數(shù)。對發(fā)酵液的活菌數(shù)和芽孢數(shù)進(jìn)行綜合分析，篩選出適宜的單因素發(fā)酵條件。

1.2.3 培養(yǎng)基綜合發(fā)酵條件的優(yōu)化（正交試驗） 對單因素試驗篩選出的主要因素，應(yīng)用正交試驗做進(jìn)一步的優(yōu)化。

1.2.4 其他發(fā)酵條件的優(yōu)化 按照1.2.1.2 流程進(jìn)行種子制備，采用正交試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，固定其他發(fā)酵條件，在OD 無明顯變化時取樣測定芽孢數(shù)。根據(jù)芽孢數(shù)，確定最佳發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值、接種量和發(fā)酵周期。

1.2.4.1 最佳接種量的確定。接種量設(shè)2%、4%、6%、8%、10%計5 個組別，每個組別3 個平行，裝液量為200 mL/瓶（1 000 mL 三角瓶），在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下培養(yǎng)40 h，每隔2 h 取樣1 次，測定OD600。以空白培養(yǎng)基做對照。

1.2.4.2 最佳培養(yǎng)溫度的確定。接種量10%，溫度設(shè)31、34、37、40 ℃計4 個組別，每個組別3 個平行，裝液量為200 mL/瓶（1 000 mL 三角瓶），在轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)40 h，每隔2 h 取樣1 次，測定OD600。以空白培養(yǎng)基做對照。

1.2.4.3 初始pH 值的確定。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值對微生物生長以及產(chǎn)物合成有重要影響，對發(fā)酵過程中各種酶的活性也有重要影響。培養(yǎng)基的初始pH 值對細(xì)胞生物量有重大影響，利用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH 值設(shè)6.0、6.5、7.0、7.5 、8.0 計5 個組別，每個組別3 個平行，裝液量為200 mL/瓶（1 000 mL 三角瓶），在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下培養(yǎng)40 h，每隔2 h 取樣1 次，測定OD600。以空白培養(yǎng)基做對照。

1.2.5 發(fā)酵生長曲線的測定 采用比濁法，測定OD600。按1.2.1.2 進(jìn)行種子制備，采用正交試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 值7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量10%，采用10 L 發(fā)酵罐，常規(guī)裝液量70%，溶氧≥80%，空氣流量與攪拌交替提升直至最大，接種后每2 h 取樣1 次，測定OD600。以空白培養(yǎng)基做對照。

1.2.6 10 t 發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)對優(yōu)化條件的驗證 按照1.2.5 的生產(chǎn)工藝控制條件，采用10 t 發(fā)酵罐進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。芽孢數(shù)檢測按照1.2.2 中的方法進(jìn)行，驗證3 批。以原工藝上年度平均生產(chǎn)水平為對照，對優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 軟件對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行分析。利用正交設(shè)計助手II v3.1 對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。

圖1 碳源種類對地衣芽孢桿菌活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of carbon sources on the number of live B. licheniformis

2 結(jié)果與分析

2.1 利用單因素試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 碳源篩選 不同碳源處理的發(fā)酵液總活菌數(shù)順序為葡萄糖＞玉米淀粉＞糖蜜＞果糖＞乳糖＞糊精（圖1），芽孢總數(shù)順序為玉米淀粉＞葡萄糖＞糖蜜＞果糖＞乳糖＞糊精（圖2）。表明在對數(shù)期葡萄糖對總菌數(shù)增加作用突出，在穩(wěn)定期玉米淀粉對芽孢產(chǎn)生較為有利。綜合發(fā)酵液總活菌數(shù)和總芽孢數(shù)雙重指標(biāo)進(jìn)行分析，認(rèn)為地衣芽孢桿菌發(fā)酵時將葡萄糖作為速效碳源、玉米淀粉作為遲效碳源搭配使用較為合理。

圖2 碳源種類對地衣芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.2 Effects of carbon sources on the number of B. licheniformis spores

2.1.2 氮源篩選 不同氮源處理的發(fā)酵液總活菌數(shù)順序為黃豆粉＞酵母膏＞花生餅粉＞尿素＞蛋白胨＞玉米漿（圖3），芽孢總數(shù)順序為黃豆粉＞酵母膏＞花生餅粉＞尿素＞蛋白胨＞玉米漿（圖4）。綜合發(fā)酵液總活菌數(shù)和總芽孢數(shù)雙重指標(biāo)進(jìn)行分析，認(rèn)為地衣芽孢桿菌發(fā)酵的最佳氮源是黃豆粉。

圖3 氮源種類對地衣芽孢桿菌活菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the number of live B. licheniformis

圖4 氮源種類對地衣芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on the number of B. licheniformis spores

2.1.3 無機(jī)鹽篩選 不同無機(jī)鹽處理的發(fā)酵液總活菌數(shù) 順 序 為MnSO4·H2O ＞MgSO4·7H2O ＞CaCO3＞NaCl（圖5），芽孢總數(shù)順序為MnSO4·H2O＞MgSO4·7H2O＞CaCO3＞NaCl（圖6）。綜合發(fā)酵液總活菌數(shù)和總芽孢數(shù)雙重指標(biāo)進(jìn)行分析，認(rèn)為地衣芽孢桿菌發(fā)酵的最佳無機(jī)鹽是MnSO4·H2O。

圖5 無機(jī)鹽種類對地衣芽孢桿菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on the number of live B. licheniformis

圖6 無機(jī)鹽種類對地衣芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響Fig.6 Effects of inorganic salts on the number of B. licheniformis spores

2.2 利用正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

培養(yǎng)基配方中各個成分之間存在一定的交互影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗可以確定最優(yōu)的發(fā)酵配方。將單因素試驗篩選出的葡萄糖、玉米淀粉、黃豆粉和MnSO4·H2O，進(jìn)行L9（34） 正交試驗（表1 和2） 做進(jìn)一步的優(yōu)化。對正交試驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析，RB＞RA＞RC＞RD，表明黃豆粉對地衣芽孢桿菌發(fā)酵影響最大，其次是玉米淀粉、葡萄糖，MnSO4·H2O對發(fā)酵影響最小。綜合分析認(rèn)為，碳源、氮源、無機(jī)鹽的最佳組合為A3B3C1D1，即玉米淀粉3.0%、黃豆粉3.5%、葡萄糖1.0%、MnSO4·H2O 0.03%。

表1 正交試驗設(shè)計的因素及其水平和用量Table 1 Factors，levels and quantity of orthogonal test （%）

表2 L9（34） 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 L9（34） orthogonal test design and results

其他因素中，NaCl 用來維持細(xì)胞外液正常的滲透壓，CaCO3對發(fā)酵酸堿度起一定的緩沖作用，并對芽孢形成有正向作用，添加量可參照基礎(chǔ)配方。

2.3 其他發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗

2.3.1 最佳接種量的確定 接種量在2%～10%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，芽孢總數(shù)無明顯變化，但發(fā)酵周期明顯縮短（圖7）。結(jié)合種子罐與發(fā)酵罐常規(guī)接種比例，確定最佳接種量為10%。

2.3.2 最佳培養(yǎng)溫度的確定 在溫度31～40 ℃范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌均能夠良好生長。隨著培養(yǎng)溫度的升高，酶活性增高，總菌數(shù)和總芽孢數(shù)均呈先增加后降低的趨勢變化，其中溫度為37 ℃時指標(biāo)值最高（圖8）。因此，確定最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖7 接種量對地衣芽孢桿菌芽孢數(shù)和發(fā)酵周期的影響Fig.7 Effects of inoculation amount on the spore number and fermentation cycle of B. licheniformis

圖8 培養(yǎng)溫度對地衣芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)的影響Fig.8 Effects of culture temperature on the number of live and spores of B. licheniformis

2.3.3 初始pH 值的確定 在pH 值6.0～8.0 范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌均能夠良好生長。隨著pH 值的升高，總菌數(shù)和總芽孢數(shù)均呈先增加后降低的趨勢變化，其中pH 值為7 時指標(biāo)值最高（圖9）。因此，確定培養(yǎng)基最佳初始pH 值為7.0。

圖9 培養(yǎng)基初始pH 值對地衣芽孢桿菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)的影響Fig.9 Effect of initial pH value of culture medium on the number of live and spores of B. licheniformis

2.4 發(fā)酵生長曲線的測定

發(fā)酵周期0～2 h 為適應(yīng)期，菌體數(shù)量較少；3～18 h為對數(shù)期，菌體數(shù)量逐漸增多，繁殖速率迅速提高，且8～12 h 出現(xiàn)峰值，此時轉(zhuǎn)種較為合適；19～22 h 為穩(wěn)定期，OD 基本不變，芽孢率較高，停罐收獲較為合適；24 h 為衰亡期，之后出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，部分芽孢重新萌發(fā)為菌體，OD 值開始下降（圖10）。因此，對菌體收獲時機(jī)的把控十分重要。

圖10 地衣芽孢桿菌的生長曲線Fig.10 Growth curve of B. licheniformis

2.5 10 t 發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)對優(yōu)化條件的驗證

利用優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行10 t 發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)驗證，結(jié)果（圖11） 顯示，發(fā)酵水平較原生產(chǎn)工藝上年度平均發(fā)酵水平有了較大幅度提高。其中，20180507 和20180519 批次發(fā)酵結(jié)果較好，重復(fù)性也較好；20180514 批次由于發(fā)酵消毒過程中含水量較高，消毒后體積較大，培養(yǎng)過程中空氣流量不穩(wěn)定，致使發(fā)酵水平低于其他2 個批次，平均芽孢數(shù)為2.02×1010CFU/mL，但較優(yōu)化前原生產(chǎn)工藝的發(fā)酵水平（0.63×1010CFU/mL） 仍高2.2倍。

圖11 優(yōu)化后發(fā)酵條件下規(guī)?；a(chǎn)對芽孢數(shù)的影響Fig.11 Effect of scaled production on the spore number under the optimized fermentation condition

3 結(jié)論與討論

以一株促生、防治病害、降低農(nóng)藥殘留等綜合效果較好的農(nóng)用地衣芽孢桿菌10236 為研究對象，采用稀釋平板計數(shù)法測定其穩(wěn)定期的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，通過單因素試驗確定了該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源和無機(jī)鹽的最適組分以及其他發(fā)酵控制條件，通過正交試驗確定了發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的最佳配比。結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為葡萄糖1%、黃豆粉3.5%、玉米淀粉3%、MnSO4·H2O 0.03%、CaCO30.3%、NaCl 0.5%；最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃、接種量10%、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值7.0；在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，發(fā)酵的對數(shù)期為3～18 h，收獲時間為19～22 h。本研究條件下的發(fā)酵周期與谷春濤等[17]的試驗結(jié)果（21 h） 較吻合；與朱天輝等[18]的試驗結(jié)果（18～20 h）較接近；與崔京春等[19]的試驗結(jié)果（32 h） 縮短了10 h 左右；與豐貴鵬等[20]的試驗結(jié)果（22～24 h） 縮短了2 h 左右；與劉陽等[21]的試驗結(jié)果（14～16 h） 延長了8 h 左右。地衣芽孢桿菌發(fā)酵工藝的研究結(jié)果有所差異，分析原因認(rèn)為可能與不同人員所用的菌種、發(fā)酵培養(yǎng)基種類與配比、發(fā)酵控制條件等不同有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探討。