凌霄雁 林栩 鄭心彤 古賢君 梁釗 覃卿 杜秀日

【摘要】目的?探討瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-155mimics和miR-155 inihibitor化學(xué)合成物在足細(xì)胞中表達(dá)變化及其穩(wěn)定情況。方法?體外培養(yǎng)小鼠腎小球足細(xì)胞，用脂質(zhì)體法將miR-155mimics/NC、miR-155 inihibitor/NC、Cy3 miR-155 mimics/inhibitor NC轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，構(gòu)建足細(xì)胞內(nèi)miR-155高表達(dá)模型、低表達(dá)模型、熒光基團(tuán)。然后用免疫熒光顯微鏡觀察不同劑量LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染不同濃度Cy3 miR-155 NC后的熒光轉(zhuǎn)染效果。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞中miR-155mimics濃度梯度（50、80、100 nmol/mL）、miR-155 inihibitor濃度梯度（80、100、150 nmol/mL）的miRNA-155表達(dá)。結(jié)果?達(dá)到一定劑量的LipofectamineTM 2000足以飽和不同濃度的miRNA，并將不同濃度Cy3 miR-155 NC成功轉(zhuǎn)入足細(xì)胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-155mimics、miR-155 inihibitor 24 h后，miR-155在足細(xì)胞中的表達(dá)明顯改變，與陰性對(duì)照組（NC）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染80 nmol/mL濃度的miR-155mimics，miR-155在足細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào) （P<0.001），與其他濃度對(duì)比表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染150 nmol/mL濃度的miR-155 inihibitor，miR-155在足細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.001），與其他濃度對(duì)比表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論?LipofectamineTM 2000達(dá)到適當(dāng)劑量時(shí)將各工作濃度的miRNA-155轉(zhuǎn)入足細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效果高。80 nmol/mL的miR-155mimics和150 nmol/mL的miR-155 inhibitor可能較適合用于實(shí)驗(yàn)研究。

【關(guān)鍵詞】足細(xì)胞;miR-155 mimics;miR-155 inihibitor;LipofectamineTM 2000

中圖分類號(hào)：R329.2+6?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.002

【Abstract】Objective?To investigate the expression and stability of transiently transfected miR-155mimics and miR-155 inhibitor chemical compounds into podocytes.Methods?Mouse glomerular podocytes were cultured in vitro，and miR-155 mimics/NC，miR-155 inhibitor/NC，Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC were transfected into podocytes by liposome method to construct miR-155 high expression model or low expression model and fluorophore in podocytes.The transfection effect of different doses of LipofectamineTM 2000 transfecting different concentrations of Cy3 miR-155 NC was observed by immunofluorescence microscopy.miRNA-155 expression transfected with miR-155 mimics at concentration gradient （50，80，100 nmol/mL） or miR-155 inhibitor at concentration gradient （80，100，150 nmol/mL） in podocytes was detected by qRT-PCR.Results?A fixed dose of LipofectamineTM 2000 was sufficient to saturate different concentrations of miRNA，and different concentrations of Cy3 miR-155 NC were successfully transferred into podocytes，and the transfection efficiency was over 80%.qRT-PCR results showed that the expression of miR-155 in podocytes was significantly changed after transfection of miR-155 mimics or miR-155 inhibitor for 24 h，and the difference was statistically significant compared with the negative control group（NC），indicating a successful transfection.When transfected with miR-155mimics at a concentration of 80 nmol/mL，the expression of miR-155 in podocytes was significantly up-regulated compared with other concentrations（P<0.001）.And when transfected with miR-155 inhibitor at 150 nmol/mL，miR-155 expression in podocytes was significantly down-regulated?compared with other concentrations（P<0.001）.Conclusion?With appropriate dose of LipofectamineTM 2000，the transfection efficiency of working concentration of miRNA-155 into podocytes is high.Concentrations of 80 nmol/mL miR-155 mimics and 150 nmol/mL miR-155 inhibitor may be suitable for experimental studies.

【Key words】podocyte;miRNA-155 mimics;miRNA-155 inihibitor;LipofectamineTM 2000

微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在生物生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡及疾病發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其作用機(jī)理是與靶基因完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因水平實(shí)行負(fù)性調(diào)節(jié)。miRNA在不同腎臟疾病如腎病綜合征、糖尿病腎病、IgA腎病、狼瘡性腎炎、多囊性腎病和移植排斥反應(yīng)等具有特異性的表達(dá)譜[1]。足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度特異、終末分化、位于基底膜最外層的上皮細(xì)胞，與基底膜、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能與微小病變腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化（FGSG）、膜性腎病、糖尿病腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎等腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)理密切相關(guān)[2]。我們之前用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模擬腎病模型，發(fā)現(xiàn)miRNA-155表達(dá)上升[3]，但miRNA-155是否在足細(xì)胞損傷中起著調(diào)節(jié)作用尚不清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155mimics和miR-155 inihibitor化學(xué)合成物，目的是篩選出適合今后實(shí)驗(yàn)的化學(xué)合成物濃度，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的足細(xì)胞miRNA-155高表達(dá)和低表達(dá)，以期為進(jìn)一步深入研究miRNA-155在足細(xì)胞損傷的作用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

腎小球足細(xì)胞株（MPC5）購(gòu)于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心，RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）、胎牛血清（以色列BI-04-002-1A），LipofectamineTM 2000（invitrogen），miR-155mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC、Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC均購(gòu)買(mǎi)于廣州銳博公司，RNAiso Plus RNA 提取試劑盒（日本TaKaRa 9108），Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis Kit（美國(guó)clontech 638315），SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa，RR820A），miRNA-155 Forward primer由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1（miRNA mRQ 3primer由TaKaRa公司提供，為其專利，不提供具體堿基序列）。

1.2?足細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)方法參考本課題組的前期研究，稍作修改[4]。細(xì)胞復(fù)蘇后，每2～3 d換液1次，細(xì)胞融合至80%左右消化傳代，在含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。14 d左右分化成熟后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3?實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞傳代后，以0.4×105～1×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種于24孔板或6孔板中，待各組細(xì)胞融合至50%～70%后用含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液同步化24 h。參照說(shuō)明書(shū)化學(xué)合成miRNA工作濃度范圍10～200 nmol/mL，將Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC分五組濃度梯度（50、80、100、120、150 nmol/mL）、miR-155mimics/mimics NC分三組濃度梯度（50、80、100 nmol/mL）、miR-155 inihibitor/inhibitor NC分三組濃度梯度（80、100、150 nmol/mL）。同時(shí)根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000的用量分組，miRNA∶LipofectamineTM 2000用量比值為1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL）。或Cy3 miR-155 NC、miR-155mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC為以上濃度不變，而LipofectamineTM 2000在24孔板用量為1.5 μL，6孔板用量為7.5 μL，具體分組詳見(jiàn)表2。

1.4?細(xì)胞轉(zhuǎn)染

分別將Cy3 miR-155 NC、miR-155 mimics/mimicsNC、miR-155inihibitor/inhibitor NC、脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000加入相應(yīng)劑量的OPTI-MEM培養(yǎng)基中靜置5 min，然后與LipofectamineTM 2000一一對(duì)應(yīng)混勻，室溫靜置20 min后分別加入24孔板或6孔板中，孵育4～6 h后改用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.5?miRNA-155熒光轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

24小時(shí)后通過(guò)免疫熒光倒置顯微鏡觀察計(jì)數(shù)表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞，掃描采集圖像。隨機(jī)取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每個(gè)視野下表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比（轉(zhuǎn)染細(xì)胞率=熒光表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%），取其平均值作為轉(zhuǎn)染效率。

1.6?Real-time RT-PCR檢測(cè)miRNA-155表達(dá)

按照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取各實(shí)驗(yàn)組小鼠足細(xì)胞的總RNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280及RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。選取U6作為miRNA的內(nèi)參，檢測(cè)miR-155、U6的mRNA表達(dá)。以2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCT=（CT實(shí)驗(yàn)組目的-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參）-（CT對(duì)照組目的-CT對(duì)照組內(nèi)參）。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)?果

2.1?足細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

在24孔板中將1.5 μL LipofectamineTM 2000和Cy3 miRNA-155 mimic/inhibitor NC或按照1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL）比值（表2）轉(zhuǎn)入足細(xì)胞中，24 h后在熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)其轉(zhuǎn)染的熒光圖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染比值為20/1時(shí)，即Cy3用量與LipofectamineTM 2000一致時(shí)，足細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)了明顯的熒光（圖1B，D），其他比值LipofectamineTM 2000用量大于等于1.5 μL時(shí)，足細(xì)胞也出現(xiàn)了較明顯的熒光（圖1F，H，J），并且熒光效率都能達(dá)到80%以上。而LipofectamineTM 2000用量小于1.5 μL時(shí)，足細(xì)胞只見(jiàn)散在的熒光點(diǎn)，胞質(zhì)中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的熒光（圖2B，D），未轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞是沒(méi)有熒光的。在6孔板中將7.5 μL LipofectamineTM 2000與Cy3 miRNA-155mimic/inhibitor NC轉(zhuǎn)入足細(xì)胞中，24 h后在熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)其轉(zhuǎn)染的熒光，如圖3所示：轉(zhuǎn)染Cy3 miRNA-155 NC后的足細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)了明顯的熒光（圖3B，D），并且熒光效率都能達(dá)到80%以上。而未轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞是沒(méi)有熒光的。

2.2?miR-155mimics轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后引起miR-155水平升高

將不同濃度miR-155mimics和miR-mimics NC分別轉(zhuǎn)入足細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞，提取RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)。如圖4所示：與miR-mimics NC相比，miR-155mimics轉(zhuǎn)染后miR-155水平顯著上調(diào)（P<0.001），且轉(zhuǎn)染濃度為80 nM的miR-155 mimics上調(diào)最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.3?miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后引起miR-155水平降低

將不同濃度miR-155 inhibitor和miR-inhibitor NC分別轉(zhuǎn)入足細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞，提取RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)。如圖5所示：與miR-inhibitor NC相比，miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-155水平顯著下調(diào)（P<0.001），且轉(zhuǎn)染濃度為150 nM的miR-inhibitor，細(xì)胞miR-155的RNA下降水平低于濃度為80 nM和100 nM的miR-inhibitor，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P=0.001）。

3?討?論

微小RNA（miRNA）幾乎參與所有細(xì)胞功能的調(diào)控，腎臟發(fā)育過(guò)程中需要miRNA的活性調(diào)節(jié)，作為調(diào)節(jié)腎臟的病理生理基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，在腎臟健康和疾病中起著關(guān)鍵作用[5]。近年來(lái)miRNA在足細(xì)胞中的表達(dá)和功能分析取得了進(jìn)展，甚至可能成為疾病生物標(biāo)志物和治療的重要靶點(diǎn)。在膜性腎?。∕N）中，檢測(cè)到七種足細(xì)胞特異性miRNA，例如特異性腎連蛋白（nephronectin，NPNT）的miR-378a，Müller-Deile等人[6]發(fā)現(xiàn) miR-378a-3p可抑制基底膜中足細(xì)胞衍生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白NPNT的表達(dá)水平，引起足細(xì)胞損傷。Ramezani等人[7]提取FGSG患者尿液的外泌體miRNA，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-155水平上調(diào)。Beltrami等[8]在糖尿病腎病患者尿液中也發(fā)現(xiàn)miR-155水平表達(dá)明顯增加，認(rèn)為其可成為生物標(biāo)志物。在狼瘡性腎炎患者的血漿中，Zununi等[9]發(fā)現(xiàn) miR-155水平顯著增加，可能提示炎癥反應(yīng)活動(dòng)期，且與炎癥介導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮損傷和纖維化相關(guān)。

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障不可缺少的重要部分，它的損傷涉及人類許多腎臟疾病，因此miR-155成為腎小球疾病的生物標(biāo)志物前景是可預(yù)見(jiàn)的。我們課題組前期研究結(jié)果已經(jīng)表明miRNA-155在足細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化[3]，然而miR-155在足細(xì)胞中的功能如何，其參與足細(xì)胞損傷的具體機(jī)制不詳，這是我們今后所研究的方向。

micrONTM miRNA mimic是一種化學(xué)合成的miRNA 模擬物，模擬細(xì)胞中成熟miRNA 的高水平表達(dá)，使內(nèi)源miRNA的調(diào)控作用增強(qiáng)。micrOFFTM miRNA inhibitor也是化學(xué)合成經(jīng)特殊修飾的miRNA抑制劑，通過(guò)特異性結(jié)合成熟miRNA分子而抑制細(xì)胞中miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用。作為專門(mén)用于miRNA功能研究的化學(xué)合成物，它們更容易控制轉(zhuǎn)染工作濃度，操作方便快捷，高效能且可以縮短實(shí)驗(yàn)周期，因此miRNA mimic和 miRNA inhibitor是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染較為理想的選擇，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用都很廣泛。然而在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，許多不同miRNA，甚至同個(gè)miRNA，miRNA mimic和 miRNA inhibitor用于實(shí)驗(yàn)的工作濃度并不一致，文獻(xiàn)也并沒(méi)有闡明選擇的理由。miRNA mimic和 miRNA inhibitor在不同的生產(chǎn)來(lái)源有一定的差異，在不同的細(xì)胞中表達(dá)功能也不完全一致，轉(zhuǎn)染試劑和方法也有所不同。

在動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞[10]中使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?LTX & Plus轉(zhuǎn)染100 nmol/mL miR-155mimic或miR-155 inhibitor，并在不同時(shí)間梯度檢測(cè)miR-155的有效表達(dá)量。在心肌細(xì)胞中，有文獻(xiàn)選擇miR-155 mimic工作濃度為50 nmol/mL，使用X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染[11]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，首先使用轉(zhuǎn)染成功指示劑Cy3 miR-155 NC對(duì)化學(xué)合成物miRNA在足細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行初步觀察。根據(jù)說(shuō)明書(shū)miRNA mimic起始工作濃度為50 nmol/mL，miRNA inhibitor為100 nmol/mL，并參考文獻(xiàn)，將Cy3 miR-155 NC分為不同濃度梯度，同時(shí)根據(jù)miRNA公司推薦轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000的用量進(jìn)行分組，miRNA∶LipofectamineTM 2000用量比值為1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL），或根據(jù)LipofectamineTM 2000公司推薦，24孔板用量為1.5 μL和6孔板用量為7.5 μL進(jìn)行分組。在24孔板中轉(zhuǎn)染24 h后，免疫熒光顯微鏡觀察表明轉(zhuǎn)染時(shí)LipofectamineTM 2000要達(dá)到一定適當(dāng)?shù)牧浚拍茱柡筒煌瑵舛鹊膍iRNA，將Cy3 miRNA-155 NC成功轉(zhuǎn)入足細(xì)胞內(nèi)。6孔板中轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證LipofectamineTM 2000只有達(dá)到適當(dāng)?shù)膭┝坎抛阋詫⒏鞴ぷ鳚舛鹊膍iRNA-155成功轉(zhuǎn)入足細(xì)胞內(nèi)，并且熒光效率能達(dá)到80%以上。接著我們按照以上試劑用量及實(shí)驗(yàn)方法，用qRT-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá)量變化情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155 mimic，miR-155在足細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)顯著，轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155 inhibitor后，miR-155表達(dá)也均明顯下調(diào)。研究結(jié)果表明miR-155mimi和miR-155 inhibitor在足細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功，并且濃度80 nmol/mL miR-155mimic的miR-155表達(dá)上調(diào)比其他兩個(gè)濃度高，濃度150 nmol/mL miR-155 inhibitor 的miR-155表達(dá)下調(diào)比其他兩個(gè)濃度低，這兩個(gè)工作濃度可能較適合用于我們的實(shí)驗(yàn)研究。

有研究者使用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染30 nmol/mL和50 nmol/mL兩個(gè)濃度的miR-30 inhibitor入足細(xì)胞[12]，結(jié)果顯示濃度50 nmol/mL即對(duì)靶基因有明顯作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇化學(xué)合成物，對(duì)其進(jìn)行濃度、劑量摸索，為后期的實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備，后期我們將對(duì)轉(zhuǎn)染時(shí)間和對(duì)靶蛋白的作用予進(jìn)一步的研究。

參?考?文?獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-10-11?修回日期：2019-11-14）

（編輯：王琳葵?梁明佩）