李林峰，董賀文，柳丹鳳，田甜，代號(hào)，劉敏

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，因電擊導(dǎo)致死亡的案件時(shí)常發(fā)生，其原因多為意外，也可見(jiàn)于自殺和他殺[1-2]。根據(jù)體表有無(wú)明顯電流斑，可以將電擊傷分為典型與非典型兩類(lèi)[3]。電擊死亡的診斷一般是以典型電流斑和皮膚金屬化等特征作為主要依據(jù)，但在許多情況下，電擊局部皮膚不會(huì)形成典型的電流斑[4]，此類(lèi)非典型電流損傷的診斷較為困難。另外，部分犯罪嫌疑人行兇后會(huì)電擊死者尸體形成電流斑，偽裝成被害人自行或意外觸電死亡[5]，而單純通過(guò)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分電流損傷發(fā)生在死亡之前還是之后[6]，故生前電擊死與死后電擊的鑒別亦是法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中的一大難題。近年來(lái)，部分學(xué)者應(yīng)用電子顯微鏡、理化檢查、免疫組織化學(xué)等方法試圖尋找生前非典型電擊死亡的特征性變化[7-8]，但目前仍然難以準(zhǔn)確診斷非典型電擊死亡及鑒別生前或死后電流損傷。

WANG等[9]發(fā)現(xiàn)，除電流斑等觸電部位的直接改變外，電流作用于人體導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡的機(jī)制更多體現(xiàn)在間接的全身作用，不僅可引起心、腦功能障礙，電流通過(guò)各種組織時(shí)均能造成一定的損傷及分子生物學(xué)改變。而代謝組學(xué)是研究生物體被內(nèi)在或外在因素?cái)_動(dòng)后整個(gè)機(jī)體代謝的變化軌跡來(lái)反映某種病理生理過(guò)程中所發(fā)生的一系列生物事件的一門(mén)科學(xué)，目前已廣泛應(yīng)用于毒（藥）物分析、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域[10]。本研究擬建立大鼠生前非典型電擊死模型，運(yùn)用核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance spec?troscopy，1H NMR）代謝組學(xué)方法對(duì)大鼠的血清進(jìn)行分析，尋找差異代謝物，以期為生前非典型電擊死的判定及其與死后即刻電擊的鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

600 MHz核磁共振波譜儀（美國(guó)Bruker公司），5mm核磁管（美國(guó)Wilmad-LabGlass公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組、非典型電擊死組、死后即刻電擊組、機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組和高溫?fù)p傷死亡組，每組5只。本研究獲得四川大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物模型制作及樣品制備

非典型電擊死模型：參照WANG等[9，11]方法制作大鼠非典型電擊死模型。腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3mL/100g）麻醉后將大鼠左前肢與右后肢用生理鹽水浸潤(rùn)，外包以生理鹽水浸濕的紗布，用自制的電擊裝置施以110V交流電電擊約3min致死，電擊局部均未查見(jiàn)電流斑形成。

死后即刻電擊模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死，死后立即用前述電擊方法電擊相同部位3 min，電擊局部均未查見(jiàn)電流斑形成。

機(jī)械性窒息死亡模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3mL/100g）麻醉后將大鼠置于密閉容器內(nèi)直至死亡。

機(jī)械性損傷死亡模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3mL/100g）麻醉后用自制的自由落體打擊裝置打擊大鼠頭部，頭部與砝碼之間以厚約5 cm的海綿隔開(kāi)，砝碼質(zhì)量5kg，自由落體高度60cm。打擊后約1min大鼠死亡。

高溫?fù)p傷死亡模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）麻醉后將乙醇灑于大鼠體表燃燒約1min后致死，皮膚燒傷Ⅰ度～Ⅱ度。

對(duì)照組：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100g）麻醉后直接采用頸椎脫臼法將大鼠處死。

建模后，取各組大鼠腹主動(dòng)脈血液2mL，置于離心管中，靜置30min。待血液自然凝固后在室溫下以離心半徑16cm，3000r/min，離心10min，取上清液分裝于凍存管中，于-80℃冰箱中保存。測(cè)試前將樣本取出，室溫解凍，在4℃下以離心半徑10cm，14000r/min，離心10min，取400μL上清液，添加99%重水100μL，于5mm核磁管中混勻，在25℃下進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 核磁共振波譜的采集及數(shù)據(jù)前處理

本實(shí)驗(yàn)采用600MHz核磁共振波譜儀，調(diào)用弛豫時(shí)間編輯Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列采集小分子信號(hào)，并壓制水峰，去除大分子蛋白。具體參數(shù)：采用預(yù)飽和方式抑制水峰，弛豫延遲時(shí)間為5 s，譜寬12 335 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 000，累加次數(shù)64次；自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過(guò)傅里葉變換轉(zhuǎn)為一維核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectros?copy，NMR）譜圖。

用MestReNova 11.0軟件（西班牙Mestrelab Re?search公司）對(duì)一維NMR譜圖進(jìn)行基線調(diào)整，相位校正，并于肌酸所在的3.05×10-6處定標(biāo)，將δ0.5～9.0的譜圖進(jìn)行分段積分（每段0.04×10-6），同時(shí)去掉殘余水峰（δ4.6～5.2），將所產(chǎn)生的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化，以Excel文件格式輸出保存，用于模式識(shí)別分析。

1.5 模式識(shí)別分析

將存有全部積分的Excel文件導(dǎo)入SIMCA-P 11.0軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行模式識(shí)別分析。采用置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，其中R2X代表組分X的反差，Q2為兩兩樣本比較的準(zhǔn)確率，代表模型的預(yù)測(cè)能力；根據(jù)樣本量的大小，將置換數(shù)量設(shè)為20或50；R2、Q2終點(diǎn)越接近，R2與Q2斜率越接近，Q2小于 0時(shí)，認(rèn)為模型可靠。輸出各組比較變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）并篩選出各樣本中VIP大于1所對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移的不同積分值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將篩選出的積分值導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，將存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的化學(xué)位移及所對(duì)應(yīng)的峰可能的類(lèi)型帶入人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Me?tabolome Database，HMDB）進(jìn)行對(duì)比，篩選得到的代謝物視為有差異的標(biāo)志代謝產(chǎn)物。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一維核磁共振氫譜（1D-1H NMR）譜圖初步對(duì)比

經(jīng)觀察比較，發(fā)現(xiàn)非典型電擊死組與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組、對(duì)照組的1D-1H NMR譜圖在δ1.15～1.25、δ3.15～3.30、δ3.60～3.72、δ4.0～4.1、δ5.2～5.3譜峰存在明顯差異（圖1）。

非典型電擊死組與死后即刻電擊組、對(duì)照組的1D-1H NMR譜圖在δ1.3～1.4、δ1.45～1.55、δ2.35～2.45、δ3.2～3.3、δ3.4～3.5、δ3.5～3.6、δ3.75～3.80、δ4.1～4.2、δ5.2～5.3譜峰存在明顯差異（圖2）。

2.2 標(biāo)志代謝物篩選結(jié)果

得到的1D-1H NMR譜圖經(jīng)基線調(diào)整、相位校正、定標(biāo)、積分、歸一化等處理后，運(yùn)用SIMCA-P 11.0軟件輸出多種模式下各組相應(yīng)的得分圖及載荷圖，比較后發(fā)現(xiàn)OSC-PLS-DA模式識(shí)別效果最好。

2.2.1 非典型電擊死組與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組、對(duì)照組間的比較

在OSC-PLS-DA模式下得到的得分圖與載荷圖提示，非典型電擊死組及對(duì)照組與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組之間分別比較，均存在一些離原點(diǎn)越遠(yuǎn)、分布較分散且孤立的差異性化學(xué)位移（圖3～5）。

圖1 非典型電擊死組與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組、對(duì)照組的1D-1H NMR譜圖

圖2 非典型電擊死組與死后即刻電擊組、對(duì)照組的1D-1H NMR譜圖

圖3 非典型電擊死組（?）與機(jī)械性窒息死亡組（▲）、對(duì)照組（■）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

圖4 非典型電擊死組（?）與機(jī)械性損傷死亡組（▲）、對(duì)照組（■）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

圖5 非典型電擊死組（?）與高溫?fù)p傷死亡組（▲）、對(duì)照組（■）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

根據(jù)各分組相應(yīng)的得分圖及載荷圖結(jié)果，篩選VIP＞1的化學(xué)位移，經(jīng)單因素方差分析選擇差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的化學(xué)位移，對(duì)照HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)后，共篩選出4個(gè)位點(diǎn)上的差異物質(zhì)（表1），包含醇類(lèi)、酚類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)等多種小分子物質(zhì)。非典型電擊死組與其他死因組及對(duì)照組間上述化學(xué)位移比較，P值均＜0.05。

2.2.2 非典型電擊死組與死后即刻電擊組、對(duì)照組間的比較

在OSC-PLS-DA模式下得到的得分圖與載荷圖提示，非典型電擊死組、死后即刻電擊組和對(duì)照組間兩兩比較均存在差異性化學(xué)位移（圖6～8）。

根據(jù)各組相應(yīng)的得分圖及載荷圖結(jié)果，篩選VIP＞1的化學(xué)位移，經(jīng)單因素方差分析選擇差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的化學(xué)位移，對(duì)照HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)后，共篩選出8個(gè)位點(diǎn)上的差異物質(zhì)（表2），包含糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、酯類(lèi)、核酸等多種小分子物質(zhì)。非典型電擊死組與死后即刻電擊組及對(duì)照組間上述化學(xué)位移點(diǎn)比較，P值均＜0.05。

表1 非典型電擊死組與其他死因組及對(duì)照組間標(biāo)志性代謝物篩選結(jié)果

圖6 非典型電擊死組（?）與對(duì)照組（■）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

圖7 死后即刻電擊組（?）與對(duì)照組（■）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

圖8 非典型電擊死組（■）與死后即刻電擊組（?）比較的OSC-PLS-DA得分圖及載荷圖

表2 非典型電擊死組與死后即刻電擊組及對(duì)照組間標(biāo)志性代謝物篩選結(jié)果

3 討 論

3.1 代謝組學(xué)在非典型電擊死診斷中的價(jià)值

電擊發(fā)生時(shí)除電流本身對(duì)心、腦等重要器官有直接作用，還可使電擊局部產(chǎn)生電燒傷、呼吸肌強(qiáng)直或痙攣導(dǎo)致窒息，同時(shí)，與帶電物體的接觸及電擊后倒地、摔跌等均可能導(dǎo)致死者出現(xiàn)機(jī)械性損傷[6]，因此無(wú)電流斑非典型電擊死的診斷及與高溫?fù)p傷死亡、機(jī)械性窒息死亡、機(jī)械性損傷死亡之間的鑒別一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。PRINDEZE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，電擊傷可引起全身多器官組織細(xì)胞產(chǎn)生病理學(xué)變化，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子及效應(yīng)蛋白的產(chǎn)生和表達(dá)，影響機(jī)體的新陳代謝。本研究對(duì)非典型電擊死組代謝產(chǎn)物與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組的代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)非典型電擊死組與機(jī)械性窒息死亡組、機(jī)械性損傷死亡組、高溫?fù)p傷死亡組之間均存在差異性化學(xué)位移點(diǎn)，說(shuō)明利用代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒎堑湫碗娏鲹p傷死亡與前述死亡原因區(qū)分開(kāi)。經(jīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，共篩選出4個(gè)具有鑒別價(jià)值的化學(xué)位移點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的多種代謝物，涉及能量代謝、糖代謝等多種代謝途徑，而這些差異性改變?cè)谄渌劳鲈蚪M內(nèi)均未查見(jiàn)，具有診斷非典型電流損傷死亡的潛力。本研究結(jié)果提示，1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)有望為非典型電擊死的診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 代謝組學(xué)在生前電擊死與死后即刻電擊死鑒別中的價(jià)值

王曄等[13]研究發(fā)現(xiàn)，生前電擊死模型與死后電擊模型相比，骨骼肌中HSP70 mRNA及C-fos mRNA的表達(dá)存在一定差異；袁增瓊等[14]研究結(jié)果顯示，肌肉細(xì)胞特異性泛素蛋白連接酶1的表達(dá)亦在生前電擊死組與死后電擊組之間存在差異性變化。但目前仍無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分生前電流損傷死亡與死后即刻電擊。本研究對(duì)非典型電擊死組代謝產(chǎn)物與死后即刻電擊組、對(duì)照組代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較，共篩選出8個(gè)具有生前非典型電擊死鑒別價(jià)值的化學(xué)位移點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的多種代謝物，涉及糖代謝、能量代謝、氨基酸代謝、核酸代謝等多種代謝途徑。本研究結(jié)果說(shuō)明，1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)能夠在一定程度上鑒別生前非典型電擊死與死后即刻電擊。

本研究將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于非典型電流損傷死亡的診斷及鑒別中，為尋找、發(fā)現(xiàn)具有鑒別價(jià)值的差異性生物標(biāo)志物提供了全新的方向。然而，本研究雖然發(fā)現(xiàn)了存在鑒別價(jià)值的差異性化學(xué)位移點(diǎn)，但這些化學(xué)位移點(diǎn)同時(shí)代表著多個(gè)不同的代謝物，后續(xù)研究可利用二維核磁共振圖譜或其他代謝組學(xué)方法推斷具體的代謝物，進(jìn)而明確標(biāo)志性代謝物所涉及的代謝通路。