徐恩宇，張?jiān)品澹胃?，蔣銳，劉光琴，劉俊亭

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)毒物分析教研室，遼寧 沈陽 110122；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

合成大麻素類（synthetic cannabinoid，SC）新型策劃藥是人工合成的內(nèi)源性大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）和CB2 受體激動(dòng)劑[1]，經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾降低分子極性以增強(qiáng)血腦屏障通過能力，只需要很低的濃度就能產(chǎn)生比天然大麻更強(qiáng)的效力。1-戊基-3-（2-氯苯乙酰基）吲哚［2-（2-chlorophenyl）-1-（1-pentyl-1H-indol-3-yl）ethanone，JWH-203］、1-戊基-3-（4-甲基-1-萘甲?；┻胚幔郏?-pentyl-1H-in?dol-3-yl）（4-methylnaphthalen-1-yl）methanone，JWH-122］、N-（1-金剛烷基）-1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-adamantyl）-1-（5-fluoropentyl）-1H-indazole-3-carboxamide，5F-APINACA］、N-（1-氨甲?；?2-甲基丙基）-1-（環(huán)己基甲基）吲唑-3-甲酰胺［N-（1-amino-3-methyl-1-oxobutan-2-yl）-1-（cyclohexylmethyl）-1H-indazole-3-carboxamide，ABCHMINACA］作為國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的合成大麻素的典型，已于2015年10月被我國列為第一類精神藥品加以管制[2]。合成大麻素類種類繁多且更新速度極快，在生物樣品如血液中濃度低，檢測時(shí)限短，難以檢測[3-5]，在常規(guī)毒物篩查中多為陰性，目前檢測方法報(bào)道不多，基于紅外光譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高分辨質(zhì)譜技術(shù)是鑒定此類未知物的有效手段。

為滿足鑒定工作的需要，本研究聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)分析檢材中的合成大麻素，建立準(zhǔn)確、快速的檢測方法，并提供4種合成大麻素的質(zhì)譜解析信息，結(jié)合分子結(jié)構(gòu)、色譜行為和CB1受體親和力信息推測未知合成大麻素的精神活性作用，為此類物質(zhì)的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1260-6420三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀、7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），SPD1010P1-230離心濃縮系統(tǒng)、SorvallTMLegendTMMicro 21R微量離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），Lab Dancer振蕩器（德國IKA公司），Simplicity 185超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（HPLC級(jí)，美國Sigma-Aldrich公司），AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA、JWH-122對照品由公安部禁毒局國家毒品實(shí)驗(yàn)室制備。

空白全血樣品采自健康受試志愿者。

1.2 溶液配制

用甲醇分別配制對照品（JWH-203、JWH-122、5FAPINACA和AB-CHMINACA）質(zhì)量濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液，置于-20℃保存。本實(shí)驗(yàn)中所用其他質(zhì)量濃度的工作液均由上述儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇稀釋獲得。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 GC-MS條件

色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm，美國 Agilent公司）。程序升溫：初始柱溫60℃，保持1 min，以20℃/min升至300℃，保持12min。氦載氣流量0.56mL/min，進(jìn)樣口溫度265℃，離子源溫度230℃，檢測器溫度150℃。結(jié)合美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）14譜庫進(jìn)行篩選。

1.3.2 LC-MS/MS條件

色譜柱為ZORBAX SB C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.8μm，美國Agilent公司）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，兩者體積比為3∶7；流速0.20mL/min；進(jìn)樣體積1 μL；采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速12 L/min；霧化器壓力45 psi；采用子離子（product ion）掃描模式進(jìn)行定性分析，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行定量分析，駐留時(shí)間為150ms。

1.4 樣品前處理

精密吸取全血樣品200 μL于2 mL離心管中，加入600μL乙腈，超聲1min，以17500×g離心3min，上清液經(jīng)離心濃縮后揮干，經(jīng)50μL甲醇復(fù)溶進(jìn)樣。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

工作曲線、檢出限（detection limit，LOD）和定量限（quantification limit，LOQ）：取空白血液200μL，添加適量的JWH-203、JWH-122、5F-APINACA和ABCHMINACA對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、10、50、100、250、1 000 ng/mL 的校準(zhǔn)樣品，按照1.4節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，按1.3節(jié)色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。分別以4種目標(biāo)物的添加質(zhì)量濃度為自變量（x，ng/mL）、第一組母離子/子離子對的峰面積為因變量（y）進(jìn)行線性回歸，以信噪比（S/N）=3確定LOD，S/N=10確定LOQ。

回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度：在空白血液中分別添加4種對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成高、中、低質(zhì)量濃度（分別為250、50、5 ng/mL）的血樣，并按照1.4節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，按1.3節(jié)色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。血樣按1.4節(jié)方法處理后，將進(jìn)樣的峰面積設(shè)為A；空白樣品按1.4節(jié)方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，將進(jìn)樣后的峰面積設(shè)為B；將對照品溶液吹干復(fù)溶后進(jìn)樣的峰面積設(shè)為C。提取回收率為A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)為B/C×100%。連續(xù)3d在同一時(shí)間分別對4種目標(biāo)物高、中、低質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測，計(jì)算日間精密度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

2 結(jié) 果

2.1 GC-MS分析

血液中4種目標(biāo)物在選定的GC-MS條件下需要21 min完成分析，色譜行為良好，總離子流色譜圖見圖 1。JWH-203、AB-CHMINACA、5F-APINACA 和JWH-122的提取離子分別為m/z214、m/z241、m/z233、m/z355，保留時(shí)間分別為16.0、17.2、19.3、20.7min。

圖1 全血中4種合成大麻素的GC-MS總離子流圖

4種目標(biāo)物的提取離子色譜圖（extracted ion chro?matogram，EIC）經(jīng)NIST 14譜庫檢索得到相應(yīng)的質(zhì)譜信息，JWH-203、5F-APINACA和JWH-122均能匹配譜庫中的結(jié)構(gòu)式信息，但AB-CHMINACA未檢索到相應(yīng)的質(zhì)譜信息，特征碎片離子為m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1。

2.2 LC-MS/MS分析

血液中4種目標(biāo)物在選定的LC-MS/MS條件下僅需5min即完成分析，色譜行為良好，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122的保留時(shí)間分別為1.17、2.24、3.07、3.68min（圖2）。

圖2 全血中4種合成大麻素的LC-MS子離子色譜圖

先對4種合成大麻素的碰撞誘導(dǎo)解離電壓優(yōu)化（優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1），使前體離子產(chǎn)生最強(qiáng)信號(hào)，再選取質(zhì)子化分子作為前體離子，獲得各種碰撞能量下的裂解信息（圖3）。

表1 全血中4種合成大麻素的質(zhì)譜參數(shù)

圖3 全血中4種合成大麻素的LC-MS質(zhì)譜信息

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

4種目標(biāo)物的線性回歸方程、LOD及LOQ見表2，回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度見表3。AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122在1～250 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.99，LOD為0.1～0.5 ng/mL，提取回收率為85.4%～95.2%，基質(zhì)效應(yīng)為80.3%～92.8%，日間精密度小于10.0%，說明該方法適用于血液中痕量合成大麻素的檢測。

表2 全血中4種合成大麻素的LOD、LOQ和線性范圍

表3 全血中4種合成大麻素的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和日間精密度 （%）

3 討 論

本研究先應(yīng)用GC-MS法對全血添加樣品進(jìn)行初步檢測，呈陽性結(jié)果的再應(yīng)用LC-MS/MS法進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)建立的快速檢測方法得到4種合成大麻素的色譜行為和質(zhì)譜解析信息，可為禁毒工作提供參考。在選定的GC-MS條件下，AB-CHMINACA在NIST 14譜庫中無信息，特征碎片離子為m/z312.3、m/z241.2、m/z145.1，與文獻(xiàn)[6-7]一致。在選定的LC-MS/MS條件下，AB-CHMINACA、JWH-203、5F-APINACA和JWH-122目標(biāo)物的特征碎片明顯區(qū)分，與文獻(xiàn)[5，8-11]一致。

本研究GC-MS法的保留時(shí)間中，JWH-203＜ABCHMINACA＜5F-APINACA＜JWH-122，而LC-MS/MS法的保留時(shí)間中，AB-CHMINACA＜JWH-203＜5FAPINACA＜JWH-122，提示合成大麻素JWH-203和AB-CHMINACA在不同的色譜條件下保留行為具有不一致性[12]。不同化合物在毛細(xì)管柱中的出峰順序主要取決于相對分子質(zhì)量和沸點(diǎn)大小，目標(biāo)物的相對分子質(zhì)量JWH-203＜AB-CHMINACA＜5F-APINACA，與出峰順序一致；JWH-122相對分子質(zhì)量較小但出峰慢，可能與其分子結(jié)構(gòu)中的萘環(huán)有關(guān)，沸點(diǎn)較高，保留時(shí)間長。

合成大麻素的精神活性作用與CB1的親和性相關(guān)，親和力K1值越低，對受體的親和力越高。4種合成大麻素與CB1的親和力K1值為AB-CHMINACA［（0.78±0.11）nmol/L］＜5F-APINACA［（1.94±0.55）nmol/L］和 JWH-122［（0.69±0.05）nmol/L］＜JWH-203［（8.0±0.9）nmol/L］[1，13-14]。5F-APINACA 和 AB-CHMINACA屬于較新的第8代吲唑酰胺類合成大麻素，分別于2013年和2015年成為德國、美國和中國等國家管制藥物，再結(jié)合液相色譜保留時(shí)間和K1值可推測：第8代吲唑酰胺類合成大麻素中，較新的AB-CHMINACA比5F-APINACA的精神活性作用更強(qiáng)（K1值低）、極性較大（保留時(shí)間短）?？傮w可以看出，新型合成大麻素的發(fā)展趨勢為精神活性作用更強(qiáng)、使用劑量更低、檢測難度更大。