林恩德 傅錦波 林福生 陳清貴 羅曄哲 洪曉泉 吳國洋

[摘要] 目的 探討術(shù)前細(xì)針穿刺BRAF基因檢測在甲狀腺微小乳頭狀癌中的臨床價值。方法 回顧性分析廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)患者臨床資料。其中<1 cm結(jié)節(jié)153例患者，≥1 cm甲狀腺結(jié)節(jié)175例患者，根據(jù)手術(shù)后組織病理學(xué)結(jié)果，觀察兩組細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)結(jié)果及BARF基因突變表達(dá)情況。計(jì)算細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)、BRAF基因突變和兩者聯(lián)合診斷的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性，組間比較采用McNemar配對資料2檢驗(yàn)。結(jié)果 以結(jié)節(jié)直徑分為兩組，<1 cm結(jié)節(jié)組中，F(xiàn)NAC在判斷結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別是88.2%、95.2%、99.2%、54.1%、89.1%;BRAF基因突變檢測在判斷結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別是91.0%、100.0%、100.0%、61.8%、92.1%;≥1 cm結(jié)節(jié)組中，F(xiàn)NAC在判斷結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別是88.8%、100.0%、100.0%、78.1%、94.3%;BRAF基因突變檢測在判斷結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確率分別是77.6%、98.0%、99.0%、63.6%、83.4%。 結(jié)論 單基因檢測BRAF突變在<1 cm結(jié)節(jié)中比FNAC有更好的診斷能力，是甲狀腺微小乳頭狀癌一個可靠的診斷指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺微小乳頭狀癌;細(xì)針穿刺;BRAF基因突變;術(shù)前診斷

[中圖分類號] R5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）12（a）-0033-03

[Abstract] Objective To explore the diagnostic value of preoperative fine needle aspiration BRAF gene detection in thyroid micropapillary carcinoma. Methods A retrospective study was conducted on the clinical data of 328 patients with thyroid nodules who underwent surgery in the Zhongshan Hospital Xiamen University from April 2017 to December 2018. 153 patients with <1 cm nodules and 175 patients with ≥1 cm thyroid nodules were observed. The sensitivity， specificity and accuracy of FNAC， BRAF gene mutation and combined diagnosis were calculated. Results In the <1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.2%， 95.2%， 99.2%， 54.1% and 89.1% ，respectively， and the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 91.0%，100.0%， 100.0%， 61.8%， 92.1% ，respectively; In the group of ≥1 cm nodule group， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of FNAC were 88.8%， 100.0%， 100.0%， 78.1% and 94.3%， respectively; The sensitivity， specificity， PPV， NPV and accuracy of BRAF gene mutation detection were 77.6%， 98.0%， 99.0%， 63.6% and 83.4%， respectively. Conclusion Single gene detection of BRAF mutation in nodules <1 cm has better diagnostic ability than FNAC.

[Key words] Thyroid micropapillary carcinoma; Fine needle aspiration; BRAF gene mutation; Preoperative diagnosis

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，在我國甲狀腺癌成為近年來增長最快的惡性腫瘤之一[1]，其中甲狀腺微小乳頭狀癌的發(fā)病率呈顯著上升，主要的原因在于高頻超聲篩查的普及，提高了<1 cm甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。彩色多普勒超聲主要通過甲狀腺結(jié)節(jié)的回聲、邊界、縱橫比、鈣化、血流情況等特征來判斷良惡性。甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（Fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）目前作為指南推薦的診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]，雖然有著簡便、安全、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但仍受到取材質(zhì)量、病理學(xué)醫(yī)師個人經(jīng)驗(yàn)等限制。該文回顧性分析廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科2017年4月—2018年12月共328例甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)患者臨床資料，擬通過聯(lián)合FNAC和BRAF基因檢測，探討B(tài)RAF基因?qū)谞钕傥⑿∪轭^狀癌的診斷價值，報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取該院就診術(shù)前同時進(jìn)行FNAC及BRAF基因檢測的328例手術(shù)患者作為研究對象，共340枚結(jié)節(jié)。術(shù)后病理證實(shí)，144枚為甲狀腺微小乳頭狀癌，125枚為甲狀腺乳頭狀癌，71枚良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者。以結(jié)節(jié)直徑為標(biāo)準(zhǔn)分為兩組，在<1 cm組中，男性36例，女性117例，年齡18～71歲，平均（45.1±10.2）歲;≥1 cm結(jié)節(jié)組中，男性41例，女性134例，年齡8～75歲，平均（49.7±13.6）歲。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)針穿刺方法? 患者取仰臥位，頸前區(qū)皮膚消毒，鋪無菌洞巾。西門子SEQOUTA型超聲探查甲狀腺結(jié)節(jié)，25G針頭在超聲引導(dǎo)下進(jìn)入可疑結(jié)節(jié)，無負(fù)壓反復(fù)提插10～15次，注射器針筒吸取4～5 mL空氣將針頭內(nèi)的標(biāo)本推至載玻片上，95%乙醇固定玻片，HE染色。再留取一針細(xì)胞樣本置2 mL生理鹽水的離心管中，4℃冰箱保存。

1.2.2? 細(xì)胞學(xué)診斷方法? 細(xì)胞涂片由同一位細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師判讀。按Bethesda分類標(biāo)準(zhǔn)將標(biāo)本分為6類：標(biāo)本無法判斷或不滿意、良性濾泡性結(jié)節(jié)、意義不明確的細(xì)胞非典型病變、濾泡性腫瘤、可疑惡性腫瘤、惡性腫瘤。該研究將可疑惡性腫瘤和惡性腫瘤歸類為細(xì)胞學(xué)陽性，將其余4種定義為細(xì)胞學(xué)陰性。

1.2.3? DNA的提取及BRAF基因突變檢測? 3 000 g離心細(xì)胞學(xué)標(biāo)本10 min，去除上清液。BRAF基因的檢測采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法，使用人類BRAF 基因V600E突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）。設(shè)計(jì)引物，上游：5-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3;下游：5-GGC CAA AAA TTT AATCAG TGG A-3，常規(guī)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。解凍混合液，并與Taq酶、待測DNA樣品以20∶0.25∶5的比例混勻，置入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。于60℃時收集FAM 和HEX 信號。樣本Ct≥28為陰性，樣本Ct<28為陽性。

1.3? 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? FNAC及BRAFV600E檢測結(jié)果

在269枚甲狀腺乳頭狀癌中，有228枚存在BRAF突變。良性結(jié)節(jié)中術(shù)后病理結(jié)果55枚結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，15枚甲狀腺濾泡性腺瘤，1枚慢性淋巴細(xì)胞甲狀腺炎。見表1。

2.2? FNAC及BRAF基因突變檢測在診斷甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)中的價值比較

將所有結(jié)節(jié)分成<1 cm結(jié)節(jié)組和≥1 cm結(jié)節(jié)組，以手術(shù)組織病理為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。相對于單一進(jìn)行FNAC檢查，F(xiàn)NAC聯(lián)合BRAF基因突變在兩組結(jié)節(jié)中的敏感度、特異度等指標(biāo)均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;在<1 cm結(jié)節(jié)組中，BRAF突變檢測的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均高于FNAC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而在≥1 cm結(jié)節(jié)組中，BRAF突變的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均低于FNAC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見表2、表3。

3? 討論

2014年世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)中顯示，甲狀腺癌的新發(fā)病例中有50%以上是微小乳頭狀癌。超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查被認(rèn)為是目前鑒別甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)最準(zhǔn)確的方法。小于1 cm的甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行細(xì)針穿刺時，結(jié)節(jié)內(nèi)提插路徑較短，針尖反復(fù)進(jìn)出結(jié)節(jié)，同時由于“部分容積效應(yīng)”，導(dǎo)致有效取材量不足。Moon等[3]研究了1 440個微小結(jié)節(jié)的FNAC結(jié)果，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)直徑每減少1 mm，標(biāo)本不滿意率持續(xù)升高。該研究中，F(xiàn)NAC在<1 cm的結(jié)節(jié)里的準(zhǔn)確度為89.1%，而在≥1 cm結(jié)節(jié)里的準(zhǔn)確度為94.3%，顯示出FNAC在甲狀腺微小結(jié)節(jié)診斷中有一定的局限性。而細(xì)針穿刺標(biāo)本中，約有7.5%的細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷為不典型細(xì)胞[4]。這部分病例可能造成外科醫(yī)師的困惑，激進(jìn)的診斷性手術(shù)可能會造成手術(shù)并發(fā)癥及甲狀腺缺失引起的甲狀腺激素終身替代;保守的觀察也許會導(dǎo)致惡性腫瘤的進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

BRAF基因作為RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。BRAF V600E基因突變在甲狀腺乳頭狀癌中的檢出率為66.2%～72.2%，與經(jīng)典型和預(yù)后差直接相關(guān)[5-6]。該研究病例中有84.8%的甲狀腺乳頭狀癌中存在BRAF突變，較以往報(bào)道較高，可能原因?yàn)樵撗芯渴褂肁RMS法進(jìn)行BRAF基因突變檢測，敏感性相對傳統(tǒng)Sanger測序法高[7]。而該次首次提出，在<1 cm結(jié)節(jié)內(nèi)，單基因BRAF突變檢測有92.1%的準(zhǔn)確度，強(qiáng)于FNAC的89.1%。原因在于基因檢測的個人經(jīng)驗(yàn)因素少，診斷特異性強(qiáng)，相比FNAC更能夠提供給外科醫(yī)師確鑿的診斷結(jié)果?？偣灿?3例患者（7.2%）細(xì)胞學(xué)為陰性，但因?yàn)锽RAF檢測為陽性，行手術(shù)治療證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌。但必須注意到，有極少數(shù)病例在良性甲狀腺腫瘤中檢測出BRAF突變 [8]。該研究亦有1例患者術(shù)前穿刺BRAF檢測出突變，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，考慮為癌前病變可能。根據(jù)該中心的經(jīng)驗(yàn)，在<1 cm的微小結(jié)節(jié)進(jìn)行細(xì)針穿刺活檢時，建議同時聯(lián)合檢測BRAF突變，避免患者因細(xì)胞診斷不明確而進(jìn)行二次穿刺，增加診療時間及患者心理負(fù)擔(dān)。

綜上所述，單基因檢測BRAF突變在<1 cm結(jié)節(jié)里體現(xiàn)出強(qiáng)于FNAC的診斷價值，可作為甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷可靠的分子標(biāo)志物。