蔣覺安 劉翠平 薛群 方琪 俞立強(qiáng) 張陸陸 蔣建華

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的炎癥性脫髓鞘疾病，T淋巴細(xì)胞功能異常在其免疫病理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用，導(dǎo)致疾病反復(fù)發(fā)作和進(jìn)行性神經(jīng)功能缺損[1]。

CD28是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子，與抗原提呈細(xì)胞上的CD80/CD86相互結(jié)合產(chǎn)生第二信號調(diào)控T細(xì)胞的活化[2]。近年來缺失CD28(CD28-)的T淋巴細(xì)胞由于其獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注。其中CD4+CD28-T細(xì)胞在自身免疫性疾病中被視作記憶性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞[3]，而CD8+CD28-T細(xì)胞則表現(xiàn)出細(xì)胞毒性或免疫抑制等不同的生物學(xué)特點(diǎn)[4]。CD45RA和CD45RO是鑒定初始性和記憶性T細(xì)胞的主要免疫標(biāo)記[5]，CD25可反映T細(xì)胞近期的活化情況[6]。在目前MS的研究中，CD4+CD28-和CD8+CD28-T細(xì)胞的臨床意義尚未完全闡明，兩者之中究竟何種細(xì)胞具有記憶性T細(xì)胞的特性亟待進(jìn)一步揭示。

為深入研究CD28-T淋巴細(xì)胞在MS疾病進(jìn)程中的變化，本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測MS患者外周血CD4+CD28-和CD8+CD28-T細(xì)胞亞群的數(shù)量以及表面CD25、CD45RA和CD45RO的表達(dá)，揭示CD28-T淋巴細(xì)胞亞群的免疫表型特點(diǎn)及其在MS中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 觀察對象選擇蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2013年6月至2018年10月收治的37例MS患者(MS組)?；颊呔?017年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。并排除：(1)半年內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素(下文簡稱“激素”)和疾病修正治療(包括環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑、干擾素-β和那他珠單抗等)；(2)合并其他免疫性疾?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病和腫瘤等；(3)合并顱內(nèi)外感染，如腦膜腦炎；(4)腦卒中等。患者中男11例、女26例，年齡(39.65±14.40)歲。病程2～240個月，中位病程(上、下四分位數(shù))為38.0(9.5，80.0)個月。擴(kuò)展殘疾狀況評分量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)[8]評分為(3.77±2.00)分。臨床分型：3例是首次起病，34例為復(fù)發(fā)緩解型，無進(jìn)展型；臨床分期：復(fù)發(fā)期23例，緩解期14例。

同時(shí)選擇33名健康志愿者作為對照組，均不伴有自身免疫性疾病、腫瘤和過敏性疾病史，近期無感染性疾病，半年之內(nèi)未曾使用過激素和免疫調(diào)節(jié)藥物，其中男10名、女23名；年齡(40.03±11.54)歲。對照組與MS組成員年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有成員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器：FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD4、CD8抗體，PE標(biāo)記的小鼠抗人CD25、CD45RA和CD45RO抗體，以及紅細(xì)胞裂解液、流式細(xì)胞儀、溫控離心機(jī)(BECKMAN)；PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗人CD28抗體，F(xiàn)ITC、PE-Cy5和PE標(biāo)記的小鼠IgG(BD Biosciences)。

1.2.2流式細(xì)胞檢測：復(fù)發(fā)期患者接受甲潑尼龍靜脈滴注治療，在其中隨機(jī)抽取7例檢測CD28-T細(xì)胞亞群的變化。治療方案：甲潑尼龍500 mg/d，靜滴4 d后調(diào)整劑量為80 mg/d，靜滴7 d。

MS組于入院第2 天清晨、對照組于體格檢查時(shí)空腹采集肘靜脈血2 mL/人，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。復(fù)發(fā)期患者于入院第2天和治療第12天清晨空腹采集肘靜脈血各2 mL/人，置EDTA抗凝管中。

設(shè)立以下檢測管，取全血50 μL/管用于流式細(xì)胞檢測：(1)CD4/CD28雙色熒光檢測管(1管)：同時(shí)加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD4和PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗人CD28抗體各4 μL/管；(2)CD8/CD28雙色熒光檢測管(1管)：同時(shí)加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD8和PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗人CD28抗體各4 μL/管；(3)CD4/CD28/(CD25、CD45RA或CD45RO)三色熒光檢測管(共3管)：同時(shí)加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD4、PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗人CD28和PE標(biāo)記的小鼠抗人CD25(或CD45RA或CD45RO)抗體各4 μL/管；(4)CD8/CD28/(CD25或CD45RA或CD45RO)三色熒光檢測管(共3管)：同時(shí)加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD8、PE-Cy5標(biāo)記的小鼠抗人CD28和PE標(biāo)記的小鼠抗人CD25(或CD45RA或CD45RO)抗體各4 μL/管。同時(shí)設(shè)立同型對照管，另取全血50 μL/管用于流式細(xì)胞檢測：(1)雙色熒光同型對照管(1管)：同時(shí)加入FITC和PE-Cy5標(biāo)記的小鼠IgG各4 μL/管；(2)三色熒光同型對照管(1管)：同時(shí)加入FITC、PE-Cy5和PE標(biāo)記的小鼠IgG各4 μL/管。各管加入抗體或小鼠IgG后室溫避光孵育20 min，再加入紅細(xì)胞裂解液250 μL/管，40℃水浴10 min后加入磷酸鹽緩沖液4 mL/管終止紅細(xì)胞裂解反應(yīng)，于離心半徑10 cm、1600 r/min離心5 min。棄上清后在細(xì)胞沉淀中加入磷酸鹽緩沖液500 μL/管，輕微震蕩后制成細(xì)胞懸液，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。各檢測管和同型對照管以前向角和側(cè)向角設(shè)門，選擇淋巴細(xì)胞群，去除單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和細(xì)胞碎片，每管獲取30×103個淋巴細(xì)胞。以相應(yīng)雙色熒光同型對照管去除背景熒光，在雙色熒光檢測管中，圈出CD4+或者CD8+T細(xì)胞，然后在該群細(xì)胞中圈出CD28-T細(xì)胞，由流式細(xì)胞儀自動計(jì)算CD4+CD28-或CD8+CD28-T細(xì)胞百分比。同樣以相應(yīng)三色熒光同型對照管去除背景熒光，在三色熒光檢測管中，圈出CD4+CD28-和CD4+CD28+以及CD8+CD28-和CD8+CD28+T細(xì)胞，由流式細(xì)胞儀檢測和自動計(jì)算各T細(xì)胞亞群中CD25+或CD45RA+或CD45RO+細(xì)胞的百分比。按陽性細(xì)胞百分比中位數(shù)判定表達(dá)強(qiáng)弱，標(biāo)準(zhǔn)為：高表達(dá)(high)：百分比>66.6%，中等表達(dá)(medium)：33.3%<百分比≤66.6%，低表達(dá)(low)：10.0%<百分比≤33.3%；弱表達(dá)(weak)：2.0%<百分比≤10.0%；陰性表達(dá)(negtive)：百分比≤2.0%。

比較分析MS患者外周血CD28-T細(xì)胞亞群的變化情況，MS患者外周血CD28-T細(xì)胞亞群表面CD25、CD45RA和CD45RO的表達(dá)情況，以及MS患者不同疾病分期及激素治療前后CD28-T細(xì)胞亞群變化情況，并分析CD28-T細(xì)胞亞群變化與MS患者神經(jīng)功能缺損(EDSS評分)及年齡的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 MS患者外周血CD28-T細(xì)胞亞群變化與對照組比較，MS患者外周血CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P=0.000)，CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量明顯下降(P=0.001)。結(jié)果見表1、圖1A。

表1 MS組與對照組外周血CD28- T細(xì)胞亞群表達(dá)比較

注：MS：多發(fā)性硬化，圖1、表2-4同

2.2 MS患者外周血CD28-T細(xì)胞亞群表面CD25、CD45RA和CD45RO的表達(dá)CD25僅在CD4+CD28+T細(xì)胞表面呈弱表達(dá)，但明顯高于CD4+CD28-T細(xì)胞(P=0.000)；在CD8+CD28+和CD8+CD28-T細(xì)胞之間比較，CD25均為陰性表達(dá)，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185)。CD45RA在CD4+CD28-T細(xì)胞表面低表達(dá)，與CD4+CD28+T細(xì)胞比較明顯降低(P=0.000)；在CD8+CD28+和CD8+CD28-T細(xì)胞表面CD45RA均為中等表達(dá)，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.270)。CD45RO在CD4+CD28-T細(xì)胞表面高表達(dá)，與CD4+CD28+T細(xì)胞比較明顯升高(P=0.000)；在CD8+CD28-T細(xì)胞CD45RO弱表達(dá)，與CD8+CD28+T細(xì)胞比較明顯降低(P=0.000)。結(jié)果見圖1B、表2。

2.3 MS患者不同疾病分期及激素治療前后CD28-T細(xì)胞亞群變化與緩解期患者和對照組比較，復(fù)發(fā)期患者CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量均明顯升高(P=0.002，P=0.000)；CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(分別P=0.012、P=0.000)；緩解期患者CD4+CD28-和CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別P=0.365、P=0.307)；結(jié)果見表3。復(fù)發(fā)期MS患者甲潑尼龍治療后CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128)；而CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量在治療后明顯升高(P=0.028)；結(jié)果見表4。

注：A：CD28- T細(xì)胞亞群；B：MS患者T細(xì)胞亞群CD25、CD45RA和CD45RO的表達(dá)；圖中數(shù)值為陽性細(xì)胞百分比中位數(shù) 圖1 外周血CD28- T細(xì)胞亞群的變化及其表面CD25、CD45RA和CD45RO表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測圖

表2MS患者外周血T細(xì)胞亞群CD25、CD45RA和CD45RO的表達(dá)〔n=9，M(QL，QU)，%〕

T細(xì)胞亞群CD25CD45 RACD45 ROCD4+CD28+組4.63(3.50,6.18)57.54(43.59,70.01)42.78(30.46,49.59)CD4+CD28-組0.63(0.47,0.90)24.50(20.12,31.04)73.65(66.36,80.84)Z值-3.576 -3.488-3.576P值0.0000.0000.000T細(xì)胞亞群CD25CD45 RACD45 ROCD8+CD28+組1.15(0.89,1.41)63.04(49.20,72.80)34.84(27.79,41.97)CD8+CD28-組0.91(0.66,1.18)50.54(40.10,66.71)6.29(4.86,8.94)Z值-1.325-1.104-3.576P值0.1850.2700.000

表3 MS組復(fù)發(fā)期和緩解期外周血CD28- T細(xì)胞亞群的比較

注：與對照組比較，*P< 0.05；與MS組緩解期比較，△P<0.05

2.4 CD28-T細(xì)胞亞群變化與MS患者神經(jīng)功能缺損及年齡的相關(guān)性MS患者EDSS評分與CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.621，P=0.000)，與CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.364，P=0.027)；MS患者年齡與CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.386，P=0.018)，與CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量無相關(guān)性(r=0.120，P=0.479)。

表4 MS患者甲潑尼龍治療前后外周血CD28- T細(xì)胞亞群的變化〔n=7，M(QL，QU)〕

注：EDSS：擴(kuò)展殘疾狀況評分量表

3 討論

研究顯示，記憶性CD4+T細(xì)胞的活化并不依賴CD28的參與[3]。本次研究發(fā)現(xiàn)MS患者外周血中同樣也存在異常升高的CD4+CD28-T細(xì)胞亞群，與Broux等的研究結(jié)果一致[9]，進(jìn)一步印證了該T細(xì)胞亞群在MS中作為記憶性T細(xì)胞的論斷。雖然CD8+T細(xì)胞在缺失CD28后的生物學(xué)特性具有不確定性[4]，但類似于Mikulkova等[10]的發(fā)現(xiàn)[9]。本研究中MS患者CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量下降，提示其在MS中可能是作為具有抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)而存在的。記憶性T細(xì)胞和Treg是維持免疫穩(wěn)態(tài)的主要組成部分，本研究以CD28分子為切入點(diǎn)，分析兩者的數(shù)量變化，期望有助于更全面的深入研究MS的免疫病理機(jī)制。

CD45RA、CD45RO和CD25是區(qū)分初始和記憶性T細(xì)胞以及T細(xì)胞近期活化的重要標(biāo)記分子[5-6]，為進(jìn)一步確定CD28-T細(xì)胞亞群的免疫表型，本研究通過三色熒光標(biāo)記測定T細(xì)胞亞群上這三個分子的表達(dá)。結(jié)果顯示CD4+CD28-T細(xì)胞表現(xiàn)為CD45ROhighCD45RAlow的免疫表型，證實(shí)該T淋巴細(xì)胞具有記憶性T細(xì)胞的特征。而與之相應(yīng)的CD4+CD28+T細(xì)胞表面CD45RA和CD45RO皆為中等水平表達(dá)，因此該T細(xì)胞亞群由初始和記憶性T細(xì)胞共同構(gòu)成。同時(shí)CD25僅在CD4+CD28+T細(xì)胞表面檢測到，說明該T細(xì)胞亞群具有近期活化的特性。由此推測，CD4+CD28+初始性T細(xì)胞初次接觸自身抗原，以CD28依賴的方式活化，部分分化成CD45RO+記憶性T細(xì)胞，少部分保留CD25+近期活化的特征。隨著患者年齡的增長，CD4+CD28+CD45RO+T細(xì)胞反復(fù)接觸自身抗原，逐漸丟失CD28形成CD4+CD28-記憶性T細(xì)胞。長期存活的CD4+CD28-記憶性T細(xì)胞隨年齡增長數(shù)量逐漸增多，因而與MS患者的年齡呈正相關(guān)，與既往的研究結(jié)果一致[11]。比較CD8+CD28-和CD8+CD28+T細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)，CD45RA+初始性T細(xì)胞在兩個亞群中所占的比例相當(dāng)，而CD8+CD28-T細(xì)胞亞群中CD45RO+記憶性T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，CD45RO-T細(xì)胞數(shù)量明顯增多。有研究顯示CD45RO也是Treg的重要標(biāo)記分子，CD45RO表達(dá)上調(diào)可以削弱其免疫調(diào)節(jié)功能，而表達(dá)下調(diào)則增強(qiáng)Treg的免疫抑制效應(yīng)[12]。由此推斷在CD8+CD28+初始T細(xì)胞初次活化后部分形成記憶性T細(xì)胞，而在丟失CD28的過程中，并未保留原有的記憶性T細(xì)胞的特征，隨之產(chǎn)生的CD8+CD28-T細(xì)胞亞群CD45RO表達(dá)下調(diào)，提示這群細(xì)胞可能是Treg。CD8+CD28-T細(xì)胞亞群并不具有記憶性T細(xì)胞的免疫表型，無長期存活的生物學(xué)特性，在本研究中其不隨患者年齡增長而增多，符合其生物學(xué)特性，與Mikulkova等[9]的研究結(jié)果一致。

在MS的臨床特征中，復(fù)發(fā)是評估MS疾病進(jìn)程的主要臨床參數(shù)之一，記憶性T細(xì)胞和Treg功能和數(shù)量異常是MS復(fù)發(fā)的重要原因[13]。長期存活的記憶性T細(xì)胞在病程中反復(fù)接觸自身抗原導(dǎo)致異?；罨?，從而引起疾病復(fù)發(fā)。因此，在本研究中CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量在復(fù)發(fā)期患者中明顯升高，而隨著疾病的緩解，記憶性T細(xì)胞的數(shù)量下降接近至健康對照水平。因此，CD4+CD28-T細(xì)胞的異常升高對于預(yù)測MS的復(fù)發(fā)具有一定的臨床意義。在免疫調(diào)節(jié)中，CD8+Treg的數(shù)量和功能下調(diào)是評估自身免疫性疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[14]，同時(shí)Treg和效應(yīng)性T細(xì)胞的失衡可能導(dǎo)致MS的復(fù)發(fā)和病情進(jìn)展[15]。由于CD8+CD28-T細(xì)胞并不具有長期存活的特性，其數(shù)量減少后不能對CD4+CD28-記憶性T細(xì)胞形成長期有效的免疫調(diào)控。本研究中CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量隨著疾病的復(fù)發(fā)明顯減少，提示其在MS免疫病理進(jìn)程中的負(fù)性調(diào)控作用被削弱，與其生物學(xué)特性相符。EDSS是反映MS疾病嚴(yán)重程度的重要臨床指標(biāo)，記憶性T細(xì)胞增多和Treg減少可以導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)，加重神經(jīng)功能缺損[13]。因此，在本研究中CD4+CD28-和CD8+CD28-T細(xì)胞的數(shù)量分別與患者EDSS呈現(xiàn)不同的相關(guān)性，借此有助于病情輕重及預(yù)后的評估。激素是治療MS急性復(fù)發(fā)最常用的藥物，研究表明激素可以下調(diào)CD28的表達(dá)以及恢復(fù)CD8+Treg的數(shù)量和功能，從而降低自身免疫性疾病的活動度[14]。然而在本研究中MS患者CD4+CD28-T細(xì)胞數(shù)量在激素治療后未發(fā)生明顯的變化，可能與記憶性T細(xì)胞對激素反應(yīng)的差異性有關(guān)[16]。由于CD4+CD28-T細(xì)胞可能是MS復(fù)發(fā)的根源之一，因此也進(jìn)一步提示延長激素用藥并不能減少M(fèi)S患者的復(fù)發(fā)，激素在MS急性復(fù)發(fā)期的治療作用可能是通過升高CD8+CD28-Treg的數(shù)量而實(shí)現(xiàn)的。由于在MS病程中CD8+CD28-T細(xì)胞亞群并無長期存活的特性，不能形成長期的免疫調(diào)控作用，也間接提示糖皮質(zhì)激素治療提高Treg的數(shù)量無法有效減少疾病的復(fù)發(fā)。目前MS患者減少復(fù)發(fā)的有效措施是緩解期的疾病修正治療，其機(jī)制與調(diào)控T細(xì)胞的活化有關(guān)[17]，深入探討干預(yù)措施對CD4+CD28-記憶性T細(xì)胞的影響可能為MS的臨床研究提供新的線索。

綜上所述，MS患者外周血中存在異常變化的CD4+CD28-和CD8+CD28-T細(xì)胞亞群，具有不同的免疫表型，與患者的復(fù)發(fā)、治療和神經(jīng)功能缺損有關(guān)，提示CD28-T細(xì)胞亞群失衡可能在MS的免疫病理進(jìn)程中有一定的作用，確切情況需要進(jìn)一步深入研究證實(shí)。