叢衡日 張明 萇浩曉 杜利 尹琳琳 張星虎

小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的免疫監(jiān)視細胞，相當于CNS內(nèi)的巨噬細胞，是維持CNS免疫平衡的一道最主要防線。小膠質細胞的活化在多種CNS疾病中發(fā)揮重要作用[1-3]，如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)等[4-5]。此外，小膠質細胞逐漸成為新的研究熱點，并有望成為藥物治療作用的靶點。多項在體實驗表明通過各種方法改善小膠質細胞的活化狀態(tài)可改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)動物的神經(jīng)功能評分[4]。淫羊藿苷(icariin，ICA)是中國傳統(tǒng)補腎良藥淫羊藿的主要單體成分，為多年生草本小蘗科植物，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎壯陽、祛風除濕之功效。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA提取物具有神經(jīng)營養(yǎng)、促進中樞髓鞘再生修復等作用[6]，進一步研究發(fā)現(xiàn)ICA及淫羊藿總黃酮具有免疫調節(jié)、抗氧化、神經(jīng)營養(yǎng)等作用[6-7]。提示ICA可能具有治療MS的潛力。目前有關ICA對小膠質細胞影響的相關體外研究尚未見報道。本研究通過采用脂多糖(LPS)+γ-干擾素(IFN-γ)復合誘導BV2 小膠質細胞構建體外神經(jīng)炎性反應的小膠質細胞模型，初步探討ICA對小膠質細胞炎性反應模型的影響。

1 材料和方法

1.1 材料BV2細胞購于北京協(xié)和細胞資源中心，ICA購于陜西寶雞市辰光生物科技有限公司(批號CAS489-32-7)。

1.2 主要試劑及儀器胎牛血清(批號10099-141)、DMEM培養(yǎng)基(批號61870-047)、青鏈霉素(批號15140-122)均購自Gibco公司，CCK-8檢測試劑盒(批號CK04)由東仁化學公司提供；一氧化氮(NO)試劑盒(批號S0021)購于碧云天公司。主要儀器包括超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、光學顯微鏡、48孔板細胞玻片(南京博巧生物科技有限公司)、恒溫水浴鍋等。

1.3 方法

1.3.1BV2小膠質細胞的培養(yǎng)：將BV2小膠質細胞置于DMEM培養(yǎng)液〔含10%(體積分數(shù))胎牛血清，1%(質量濃度)青鏈霉素〕中，于37℃、5%(體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后細胞長滿培養(yǎng)皿底面積約80%時按1∶6進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2ICA溶液制備：用DMEM培養(yǎng)基稀釋64 mmol/L的ICA貯存溶液，配置成256 μmol/L的溶液，然后進行梯度稀釋，最終得到ICA濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1 μmol/L的完全培養(yǎng)基。

1.3.3不同濃度ICA對BV2細胞存活率影響：采用CCK-8法檢測各組細胞活性。將培養(yǎng)的BV2細胞按照5×104個/mL密度接種于96孔板，100 μL/孔，每組設4個孔，置于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，棄上清。每孔分別加入100 μL含0(對照組)、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L ICA的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，每孔加11 μL CCK-8溶液，37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱孵育40 min，待上清變成鮮亮的橙紅色，從培養(yǎng)箱取出96孔板，于450 nm處測量其吸光度值，結果以與對照組比值表示。觀察不同濃度ICA對BV2細胞活性的影響，選出未明顯影響細胞活性的ICA濃度用于后續(xù)實驗。

1.3.4BV2小膠質細胞體外神經(jīng)炎性反應模型的構建和分組：將BV2細胞以1×105個/mL密度種于48孔板，250 μL/孔，每組4個孔，置于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，棄上清，再以LPS(終濃度為100 ng/mL)+IFN-γ(終濃度為10 ng/mL)復合刺激造模，于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，得到LPS+IFN-γ復合誘導的BV2小膠質細胞體外神經(jīng)炎性反應模型。將培養(yǎng)的BV2細胞隨機分為對照組、模型組以及不同濃度ICA干預組。對照組不加LPS+IFN-γ刺激及ICA干預，僅加入等體積的對應溶媒，余操作同模型組；不同濃度ICA干預組于給予BV2細胞LPS+IFN-γ刺激前，分別給予含1、2、4、8、16、32、64 μmol/L濃度ICA的完全培養(yǎng)基孵育30 min，余操作同模型組。

1.3.5細胞培養(yǎng)上清中NO水平檢測：按“1.3.4”方法進行造模及分組，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，每組4個孔，采用NO試劑盒檢測各組細胞上清液NO水平。

1.3.6ICA對BV2細胞炎性反應模型形態(tài)的影響：按“1.3.4”方法進行造模及分組后，將孔板從培養(yǎng)箱中取出，置光學顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)并拍片。每組4個孔。

1.3.7免疫熒光檢測CD16/32表達：按“1.3.6”操作步驟后，棄細胞培養(yǎng)上清，以PBS潤洗，加入4%(質量濃度)多聚甲醛溶液，固定20 min，以0.3%(體積分數(shù))PBST室溫條件破膜20 min，5%(體積分數(shù))驢血清封閉，室溫放置40 min。孵育一抗：CD16/32、Iba-1，4℃孵育過夜，避光孵育熒光二抗，將細胞玻片從48孔板中取出，放在滴有含DAPI封片劑的載玻片上，載玻片至于暗盒內(nèi)，待封片劑晾干，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，每張圖片取3～4個均一視野分析細胞免疫熒光染色的累計吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ICA對BV2小膠質細胞存活率的影響對照組及ICA不同濃度組細胞存活率間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.27，P<0.01)；與對照組比較，ICA 1～128 μmol/L干預組細胞存活率無統(tǒng)計學變化(均P>0.05)，盡管ICA 128 μmol/L干預組BV2小膠質細胞存活率與對照組無統(tǒng)計學差異，但呈輕度降低，ICA 256 μmol/L干預組細胞存活率則急劇下降(P<0.01)。故該實驗采用64 μmol/L以下濃度進行后續(xù)研究。結果見圖1。

2.2 細胞培養(yǎng)上清中NO水平比較模型組培養(yǎng)上清中CO水平較對照組明顯高〔(16.46±0.73)μmol/Lvs. (2.55±0.41)μmol/L；t=16.59，P<0.01〕。ICA不同濃度干預組及模型組間比較總體差異有統(tǒng)計學意義(F=106.66，P<0.01)，與模型組比較，ICA 16、32 、64 μmol/L干預組細胞培養(yǎng)上清中NO水平明顯降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。結果見圖2。

注：ICA：淫羊藿苷，圖2～4同；與ICA 0 μmol/L干預組(即對照組)比較，aP<0.01 圖1 CCK-8法檢測ICA對BV2細胞存活率的影響

注：NO：一氧化氮；與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01 圖2 各組BV2培養(yǎng)細胞上清中NO水平比較

2.3 ICA對BV2小膠質細胞形態(tài)的影響光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，經(jīng)LPS+IFN-γ復合誘導的BV2細胞炎性反應模型組BV2細胞胞體明顯變大，部分細胞突起增多變長，提示小膠質細胞處于活化狀態(tài)；給予ICA 32、64 μmol/L干預后，BV2細胞突起明顯減少(圖3)，而ICA 1、2、4、16 μmol/L濃度干預組較模型組比較無明顯變化。

注：A：對照組；B：模型組；C：ICA 32 μmol/L干預組；D：ICA 64 μmol/L干預組 圖3 光學顯微鏡下觀察各組BV2細胞形態(tài)(比例尺=200 μm)

注：ICA32、ICA64分別為ICA32、64 μmol/干預組 圖4 各組傳代培養(yǎng)BV2細胞CD16/32蛋白表達(紅色熒光)比較(免疫熒光染色，比例尺=200 μm)

2.4 BV2細胞CD16/32的表達對照組、模型組以及ICA 1、2、4、16、32、64 μmol/L干預組BV2細胞CD16/32表達水平分別為118.60±89.04、5823.00±109.99、5886.33±139.37、5826.33±124.92、5793.00±136.23、5750.67±91.32、3327.67±126.73、2725.00±139.37。模型組CD16/32蛋白表達較對照組明顯增多(t=48.77，P<0.01)。不同濃度ICA干預組及模型組間CD16/32表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=415.29，P<0.01)，兩兩比較結果顯示，ICA 1、2、4、16 μmol/L干預組CD16/32蛋白表達與模型組比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，而ICA 32、64 μmol/L干預組其表達水平較模型組明顯降低(均P<0.01)。結果見圖4。

3 討論

BV2細胞是一種源于C57BL/6小鼠的小膠質細胞永生細胞系[8]。小膠質細胞由于各種原因被激活后可引起炎性反應，其主要表現(xiàn)為NO、IFN-γ及前炎性細胞因子等釋放增多[9]。既往研究表明，LPS可一定程度激活BV2細胞?；罨蟮男∧z質細胞與靜息態(tài)相比呈現(xiàn)形態(tài)上的胞體變大的阿米巴活化狀態(tài)。本實驗利用IFN-γ聯(lián)合LPS刺激BV2細胞，成功構建小膠質細胞激活的模型。模型組BV2小膠質細胞胞體明顯變大，部分細胞突起增多變長，從形態(tài)學上提示小膠質細胞處于活化狀態(tài)；此外，模型組NO表達較對照組明顯高，進一步提示小膠質細胞激活模型的成功構建。LPS+IFN-γ復合誘導BV2小膠質細胞體外模型的建立，為后續(xù)小膠質細胞活化的功能研究提供了基礎。

小膠質細胞屬CNS中的固有免疫細胞，在CNS炎性免疫調節(jié)的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[10-11]。小膠質細胞通過CNS的健康神經(jīng)元營造的免疫微環(huán)境實現(xiàn)其靜止狀態(tài)[12]，當各種因素導致的這一穩(wěn)妥環(huán)境被打破時，小膠質細胞被激活，釋放炎性因子如白細胞介素1b(IL-1b)、IL-6及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，對神經(jīng)元產(chǎn)生急慢性損傷，進而導致疾病的發(fā)生[13]。因此，如何抑制小膠質細胞活化，同時降低活化的小膠質細胞的炎性反應，成為控制CNS炎性反應的關鍵。本研究結果顯示，給予ICA干預后，可明顯降低LPS+IFN-γ復合誘導的BV2小膠質細胞炎性因子NO的釋放，減少BV2細胞突起，提示ICA對激活的小膠質細胞有一定的調節(jié)作用。既往體內(nèi)外研究結果均顯示，在病理狀態(tài)發(fā)生時，向促炎的M1型活化的小膠質細胞顯著增多，且活化態(tài)的M1型小膠質細胞可分泌大量促炎因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等[14-16]，同時M1型小膠質細胞特異性的分子標志物CD86、iNOS、CD16/32等表達上調[15-17]，進而導致疾病的發(fā)生。因此，研究抑制M1型小膠質細胞的活化機制也將為CNS疾病的治療提供方向。本研究也發(fā)現(xiàn)，在體外ICA可一定程度抑制激活的小膠質細胞CD16/32蛋白表達，結合ICA對活化的小膠質細胞形態(tài)的影響及炎性因子ON釋放含量的影響，初步推測ICA能一定程度抑制小膠質細胞的活化。

綜上所述，本研究結果顯示，ICA對LPS+IFN-γ復合誘導BV2小膠質細胞活化的體外模型有一定調節(jié)作用，ICA能夠抑制激活的小膠質細胞產(chǎn)生NO，對小膠質細胞的活化可能具有一定抑制作用。由于本研究未對小膠質細胞活化的M1型相關的標志物(如iNOS和TNF-α)和其他常見炎性因子(如IL-1b、IL-6和TNF-α)進行相關研究，因此有關ICA對小膠質細胞活化機制的確切機制有待深入研究。