邢麗貞程成孔進(jìn)

(山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101)

0 引言

氮循環(huán)是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)能量循環(huán)轉(zhuǎn)化的重要組成部分，與生物代謝息息相關(guān)，其中亞硝酸鹽氧化菌NOB(Nitrite Oxidizing Bacteria)是氮轉(zhuǎn)化中重要的一環(huán)，其基本功能是將亞硝氮轉(zhuǎn)化為硝氮，提供自身所需能量的同時(shí)推動氮循環(huán)的進(jìn)行，是生態(tài)系統(tǒng)必不可少的基本微生物，傳統(tǒng)上，認(rèn)為NOB是生態(tài)位相對單一固定的硝化菌。在經(jīng)典的硝化二段理論中，NOB與氨氧化菌共同作用，將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為硝氮，這也是水處理脫氮中的基礎(chǔ)步驟和基本理論[1]。目前脫氮生物的研究多集中于氨氧化菌AOB(Ammonia Oxidizing Bacteria)或氨氧化古菌AOA(Ammonia Oxidizing Archaea)[2]與厭氧氨氧化菌[3]，對亞硝酸鹽氧化菌的研究較少，主要有：(1)由于AOB或AOA所作用的氨氧化步驟對于新的脫氮技術(shù)尤為重要，成為了脫氮效率的主要限制條件；(2)NOB的生長速度較AOB更加緩慢[4]，難以得到用于研究的足夠的生物量。近年來，隨著生物檢測新技術(shù)的應(yīng)用，對NOB的研究有了進(jìn)一步的發(fā)展，NOB的多樣性及潛力也逐漸得到重視，而全程硝化菌[5]的發(fā)現(xiàn)讓人們意識到需要重新認(rèn)識NOB及傳統(tǒng)的脫氮理論，對于NOB的生態(tài)位單一的認(rèn)識也需要進(jìn)一步提升。

1 亞硝酸鹽氧化菌概述

1.1 亞硝酸鹽氧化菌的種類

NOB是化能自養(yǎng)型微生物，除Nitrolancea hollandica外大部分是革蘭氏陰性菌[6]。目前已知的NOB包含4個(gè)門，即變形菌門(Proteobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、Nitrospinae和綠彎菌門(Chloroflexi)[6]，共 7個(gè)屬，即硝酸細(xì)菌屬(Nitrobacter)、硝酸球菌屬(Nitrotoga)、Nitrococcus、硝酸刺菌屬(Nitrospira)、Nitrospina、Nitrolancea以及Candidatus Nitromaritima[6-7]。海洋中的大部分NOB屬于Nitrospinae[8]。Nitrotoga大多分布在溫度較低的環(huán)境中(10～17℃)[9]，有的可以在中溫環(huán)境(24～28℃)中生存[7]。Nitrospira的分布較為廣泛，是污水處理中最常見的硝化菌之一[10]。Nitrospira種類繁多，適應(yīng)的溫度范圍也更大(10～28℃)[9]，有的可以適應(yīng)更高的溫度(60～65℃)，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一嗜熱型NOB[11]。此外，新發(fā)現(xiàn)的全程硝化菌也屬于Nitrospira[5，12]。NOB種類繁多，多樣的生理特性使得其可以適應(yīng)各種環(huán)境，廣泛分布在海洋、土壤、淡水及一些人工系統(tǒng)中[8-11]。

1.2 亞硝酸鹽氧化還原酶

亞硝酸鹽氧化還原酶NXR是NOB在硝化反應(yīng)中主要的作用酶，由3個(gè)亞基NxrA、NxrB、NxrC組成[13]，可以將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽并產(chǎn)生能量，維持NOB的生命活動，同樣也可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。其中NxrA、NxrB可以作為標(biāo)記物來檢測未知NOB種類[13]。NXR按空間分布可分為細(xì)胞質(zhì)NXR與周質(zhì)NXR。Nitrospina與Nitrospira的NXR屬周質(zhì)NXR，而Nitrobacter則是細(xì)胞質(zhì)NXR。NXR空間分布上的差異會造成能量產(chǎn)生上的區(qū)別，周質(zhì)NXR的質(zhì)子產(chǎn)生與消耗是從膜兩側(cè)發(fā)生的，易于質(zhì)子動力勢能PMF的產(chǎn)生，相對細(xì)胞質(zhì)NXR而言，氧化等量的亞硝酸根可以產(chǎn)生更多的能量，高效的產(chǎn)能會使周質(zhì)NXR型的NOB更能適應(yīng)低濃度底物的環(huán)境[14]。

NXR的差異可以直觀體地現(xiàn)在對于亞硝氮底物的親和力上。用Km表示NOB對于亞硝氮底物的親和力，Km小的NOB對亞硝氮底物的親和力和利用效率更高，Km大的亞硝氮底物親和力則相對較低，不同種屬的Km范圍有差異。分別測定2個(gè)典型的NOB屬(Nitrospira和Nitrobacter)對于亞硝氮底物的Km，二者的Km值有顯著差異，Nitrobacter的Km范圍為49～544 μmol/L，高于Nitrospira的Km范圍(9～27 μmol/L)[15]，這意味著Nitrospira對于亞硝氮底物的親和力要大于Nitrobacter。這種特性會使Nitrospira在低濃度亞硝氮的條件下更具競爭力，成為優(yōu)勢NOB菌群。Nitrospira與Nitrobacter恰好分別對應(yīng)了周質(zhì)NXR與細(xì)胞質(zhì)NXR，這很可能就是造成Km值大小差異的主要原因。此外，Km的差別也引出了r/K策略的推論，即底物利用策略的不同，可以通過不同NOB的Km將其粗略分為K型菌與r型菌，Km更小的Nitrospira是 K型，而Km更大的Nitrobacter就是r型。但這種分類都是相對的，如發(fā)現(xiàn)一株Nitrotoga Km為 25 μmol/L[7]，則可以將其歸為K型菌(相對Km較大的Nitrobacter)，而有的Nitrotoga的Km可以達(dá)到 89 μmol/L[7]，相對Km為25 μmol/L的Nitrotoga，則更偏向于r型菌。

NXR的差異可能是不同NOB發(fā)展進(jìn)化的結(jié)果。對比不同微生物中的NXR，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)NXR更接近于硝酸鹽還原酶(NAR)，周質(zhì)型NXR則與厭氧氨氧化菌中的NXR類似。前者可能起源自光能自養(yǎng)型微生物，而后者可能是厭氧/微氧非光能營養(yǎng)型微生物。Nitrospira缺乏一般好氧菌中存在的減少活性氧自由基危害的關(guān)鍵酶，如過氧化歧化酶，只能通過其他替代方式如細(xì)胞色素c過氧化酶和幾種硫氧還蛋白依賴性過氧還酶等維持低氧環(huán)境，減少活性氧自由基的危害[13]。這種假設(shè)可以解答許多問題，如低效率細(xì)胞質(zhì)NXR產(chǎn)生的原因，可能是光能自養(yǎng)微生物進(jìn)化中NXR并未產(chǎn)生較大變化的結(jié)果。

2 亞硝酸鹽氧化菌生態(tài)位研究

一直以來，認(rèn)為NOB是一種以亞硝氮氧化提供能量、維持生存的嚴(yán)格化能自養(yǎng)型微生物，然而NOB種類繁多，進(jìn)化多樣性導(dǎo)致其具有多種生理特性差異較大的分支，具有巨大的代謝潛力，這對NOB自身的代謝方式、NOB與其他微生物的種間關(guān)系產(chǎn)生一定的影響，NOB的生態(tài)位也變得更加多樣。

2.1 亞硝酸鹽氧化菌的生物代謝

在早期的研究中就發(fā)現(xiàn)有NOB可以利用簡單的有機(jī)物進(jìn)行代謝，Nitrobacter可以在氧化亞硝氮產(chǎn)能的同時(shí)利用丙酮酸來代謝產(chǎn)能[16]，此外，Nitrospira也可以代謝丙酮酸而產(chǎn)生能量[17]。利用宏基因技術(shù)對Nitrospira進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其具有編碼多種代謝途徑相關(guān)酶的基因，如氫氣代謝與甲酸代謝的基因。將Nitrospira置于氫氣條件下，僅以氨氮作為氮源培養(yǎng)(排除亞硝氮干擾)，菌體可繼續(xù)生長，而去除氫氣或氧氣時(shí)則無法生長。FISH檢測結(jié)果表明菌體并未受到氫營養(yǎng)細(xì)菌污染，說明Nitrospira可以純粹以氫氣氧化產(chǎn)能代謝生長，這種體系獲得的能量(ΔG°＝-237 kJ/molH2)要高于傳統(tǒng)的亞硝酸鹽體系獲得的(ΔG°＝-74 kJ/mol NO2-)[18]。

可能是因?yàn)槭芤嬗贜itrospira起源于厭氧菌，缺氧條件下的Nitrospira的代謝方式也多種多樣。Nitrospira moscoviensis中含有甲酸代謝相關(guān)酶的基因[13]。Koch等[19]在缺氧條件下培養(yǎng)Nitrospira moscoviensis，發(fā)現(xiàn)其可以利用甲酸鹽作為電子供體，硝酸鹽作為電子受體，進(jìn)行代謝活動，在添加過量甲酸鹽的情況下將硝酸鹽全部還原，而不添加甲酸鹽時(shí)沒有亞硝酸鹽產(chǎn)生。證明Nitrospira moscoviensis可以用甲酸鹽作為電子供體進(jìn)行硝酸鹽還原反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)Nitrospira moscoviensis可以在缺氧條件下，以氫氣作為電子供體把硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[20]，這可能也是NOB反應(yīng)底物的來源之一。研究結(jié)果得出了一個(gè)重要的結(jié)論：在缺氧或厭氧條件下，NOB可以通過自身的代謝提供亞硝氮維持正常生長，為Nitrospira在氮代謝的競爭中提供了巨大的優(yōu)勢。

Nitrospira與Nitrobacter可能進(jìn)化自不同的微生物，這就造成了NOB多樣化的碳代謝方式?？栁难h(huán)是大多數(shù)光能和化能營養(yǎng)型微生物的固碳方式，NOB中的Nitrobacter和Nitrococcus均采用此方式，然而Nitrospira的基因組中沒有完整的卡爾文循環(huán)基因，反而具有逆檸檬酸循環(huán)的基因[21]，說明Nitrospira的固碳方式可能是逆檸檬酸循環(huán)，這也是微氧微生物中常見的碳代謝方式，而Nitrospira也是檢測到的以這種模式合成有機(jī)物的唯一硝化菌屬[13] 。

NOB除了為人所熟知的亞硝酸鹽氧化產(chǎn)能之外，還具備了上述更多的代謝方式以適應(yīng)多種環(huán)境，而這些新的代謝方式也改變了NOB在環(huán)境中單一的亞硝酸鹽氧化的生態(tài)位，在特定環(huán)境條件下的NOB具有更加豐富多樣的生態(tài)位。宏基因組學(xué)的方法為挖掘NOB的生態(tài)位潛力提供了很好的途徑，提供了更多的研究方向與思路，與實(shí)驗(yàn)結(jié)合后得到了新的成果，可能還有更多未知的NOB代謝方式亟待發(fā)現(xiàn)。由于各種環(huán)境中亞硝氮濃度大都較低，NOB的生態(tài)位變化對于其生存競爭有重要的意義，多樣的代謝方式可能也會影響NOB在污水處理過程中的定位。

2.2 亞硝酸鹽氧化菌與其他微生物的種間關(guān)系

污水處理中，AOB可以將污水中的氨氮氧化為亞硝氮，作為NOB硝化的底物，兩者共同完成硝化作用，然而實(shí)際上，兩者的關(guān)系可能更為復(fù)雜。在氨氮濃度低的環(huán)境中，仍然存在一定量的AOB，這是因?yàn)橛械腁OB能夠分泌脲酶，可將尿素分解為氨與二氧化碳，作為氨氧化的底物[22-23]；而一些NOB同樣具有編碼脲酶的基因[13，19]，所以這些NOB可能利用尿素產(chǎn)生氨供給AOB，然后由AOB產(chǎn)生亞硝氮反過來供給NOB。Koch等[19]在尿素作為底物的條件下將可以分泌脲酶的NOB與不產(chǎn)脲酶的AOB共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩者可以共同生長并產(chǎn)生硝酸鹽，證明了兩者間的這種共同生長的作用關(guān)系。除了尿素外，氰酸鹽也可以起到類似的作用。氰酸鹽也是自然界中普遍存在的化合物，可以作為底物被各種微生物利用，部分NOB能夠分泌氰化酶并將氰酸鹽轉(zhuǎn)化為氨與二氧化碳，而以氰酸鹽為底物的AOBNOB體系的存在也證明了這一種間關(guān)系[24]。這種AOB-NOB氰酸鹽體系與尿素體系的不同點(diǎn)在于，大部分AOB/AOA并不具有分泌氰化酶的基因[24]，因此可能是氰酸鹽硝化的主要存在形式。

除了上述2種關(guān)系外，AOB與NOB之間還存在更多生理互補(bǔ)的現(xiàn)象。如鐵是硝化細(xì)菌代謝必須的元素，而AOB對鐵元素的攝取可能需要借助NOB完成。因?yàn)镹itrosomonas europaea等一些AOB并不含有編碼鐵載體的基因，也就無法直接攝取鐵元素，但是卻含有編碼鐵載體受體的基因[25]，即其可以通過與其他含有鐵載體的微生物，如Nitrobacter和Nitrospira等作用來獲得鐵元素[13]。另外，兩者之間可能存在群感效應(yīng)，N.winogradskyi可以在細(xì)菌生長階段分泌群感物質(zhì)，調(diào)節(jié)菌體密度，這種物質(zhì)的擴(kuò)散可以引起硝化細(xì)菌間的種間作用[26]，有研究表明這種群體感應(yīng)作用對于好氧硝化體系的形成有正面作用[27]。

產(chǎn)甲烷古菌是厭氧系統(tǒng)中常見的微生物，而某些古菌具有強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)力，可以分布在各種極端環(huán)境中[28]。AOA作為具有與AOB類似功能的古菌，其存在是氨氧化體系的重要一環(huán)，彌補(bǔ)了AOB在一些特殊環(huán)境中無法存在的不足。AOA與AOB之間，除了互補(bǔ)還有競爭關(guān)系[29-31]，而兩者與NOB的關(guān)系也是氮循環(huán)中的重要組成部分。葉磊等[32]對白洋淀湖岸地帶的氨氧化系統(tǒng)及氨氧化菌分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)氨氧化優(yōu)勢菌隨空間改變而發(fā)生變化，AOA與AOB共同組成了岸邊氨氧化系統(tǒng)，而岸邊地帶的主要氨氧化菌群為AOA，氨氧化系統(tǒng)表現(xiàn)出的空間異質(zhì)性較為明顯。相較于多存在于陸地與淡水系統(tǒng)的AOB而言，AOA是已知的在地?zé)岘h(huán)境中生存的好氧氨氧化菌，其分布更為廣泛，除陸地淡水系統(tǒng)外，還分布于海洋熱泉等環(huán)境中[33]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可以推測存在中、高溫下的AOA-NOB體系作為硝化的主要體系。有研究從堆肥設(shè)備中提取菌體來接種富集培養(yǎng)嗜熱硝化菌，將經(jīng)過350 d培養(yǎng)后的菌體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中進(jìn)行650 d的長期馴化，得到了高效穩(wěn)定的AOA-NOB體系，該體系可以在50℃條件下進(jìn)行穩(wěn)定的硝化活動。在這些菌體中，CandidatusNitrososphaeragargensis占 17%，Nitrospira calida占25%，AOA與NOB的活性分別為198±10和 894±81 mg N/(g VSS ·d)[34]，通過碳同位素追蹤，確定其營養(yǎng)方式為化能自養(yǎng)型。

NOB與異養(yǎng)菌之間也有著復(fù)雜的種間關(guān)系。早期已有研究表明，某些異養(yǎng)菌可以利用NOB產(chǎn)生的簡單有機(jī)物進(jìn)行生命活動[17]，反過來，在一些混合物中，NOB硝化產(chǎn)生的硝酸鹽可以被異養(yǎng)菌在缺氧條件下還原為亞硝酸鹽，擴(kuò)散到好氧區(qū)重新被NOB利用，作為氨氧化的補(bǔ)充[35]。類似現(xiàn)象也存在于NOB種群內(nèi)部，Nitrobacter可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使其重新被NOB氧化，產(chǎn)生的亞硝酸鹽作為氨氧化反應(yīng)的補(bǔ)充，為NOB活動提供必要的底物，同時(shí)也可以解釋一些區(qū)域中NOB數(shù)量遠(yuǎn)高于AOB的現(xiàn)象[35]。

基于多樣的代謝方式，NOB并不僅僅與AOB具有簡單的種間關(guān)系，這種關(guān)系可能涉及微生物生長代謝的各個(gè)方面，而AOA-NOB體系的存在可能更加廣泛，甚至可以延伸至與其他微生物間的相互作用。NOB的生態(tài)潛力使得其與其他微生物間具有多樣的種間關(guān)系，而不同的種間關(guān)系也賦予了NOB與以往認(rèn)識所不同的生態(tài)位，新的生態(tài)位意味著有更高的生存競爭力來適應(yīng)各種各樣的環(huán)境。從現(xiàn)實(shí)意義的角度來說，NOB多樣的種間關(guān)系讓其可以在不同的污水處理系統(tǒng)中發(fā)揮更大的作用。

2.3 全程硝化菌

傳統(tǒng)理論將硝化分為氨氧化與亞硝酸鹽氧化兩步。然而完全一步硝化將氨轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}的產(chǎn)生的能量(ΔG°＝-349 kJ/mol)要比任意兩步硝化產(chǎn)生的(ΔG°＝-275 kJ/mol NH3和 ΔG°＝ -74 kJ/mol)高，故而理論上應(yīng)該存在可以進(jìn)行完全氨氧化的微生物，且有可能在較低的底物條件下存在[36]。近年來，相繼有發(fā)現(xiàn)證明了全程硝化菌的存在。研究人員從俄羅斯一個(gè)1 200 m的石油勘探井底熱水下的管壁生物膜上提取到了一種Nitrospira，這是最早發(fā)現(xiàn)的全程硝化菌之一[5]。通過對提取到的細(xì)菌進(jìn)行富集檢測，發(fā)現(xiàn)了這種全程硝化菌，鑒定發(fā)現(xiàn)其基因組中含有氨氧化與亞硝酸鹽氧化的相關(guān)基因，其既可以利用氨氮加氧酶(AMO)和羥胺氧化酶(HAO)進(jìn)行氨氧化，又可以利用NAR進(jìn)行亞硝酸鹽氧化，只是全程硝化菌中的這3種酶與AOB、NOB中的酶并不完全相同[5]。Kessel等[12]從與水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)相連接的一個(gè)滴濾池的厭氧區(qū)提取樣本，并添加銨鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽進(jìn)行低氧富集培養(yǎng)，得到的菌群中厭氧氨氧化菌占45%，而類Nitrospira型菌占15%。兩者存在對底物的競爭關(guān)系，產(chǎn)生這種菌體占比的原因可能是菌體間具有其他功能聯(lián)系?；蚪M數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有2種Nitrospira存在完整的氨氧化與亞硝酸鹽氧化基因，但是并沒有其他證據(jù)表明此類菌群中有AOB/AOA的存在，后續(xù)試驗(yàn)證明了這2種Nitrospira可能具有單步硝化的潛力[12]。由于全程硝化菌中的AMO與已知AOB中的AMO結(jié)構(gòu)及編碼基因并不相同，從而可以作為其存在的參考[5，12]，在沒有被證明有完全氨氧化的能力之前，通過一般的16S rRNA或NxrB基因鑒定的方法確定NOB是否為全程硝化菌是很困難的，因而可以通過amoA的特異性來靶向鑒定[37]。通過宏基因組對比發(fā)現(xiàn)，全程硝化菌可能廣泛存在于土壤、淡水等各種自然生態(tài)系統(tǒng)和污水處理、給水處理等人工系統(tǒng)中[5，12，38-39]。

Wang等[39]通過宏基因組技術(shù)從中國海南、新加坡以及美國加州的飲用水系統(tǒng)中的4個(gè)樣品里都找到了全程硝化菌的存在，通過核糖體蛋白、amoA、hao以及NXR酶基因序列的分析得出其很可能屬于全程硝化菌，證明其廣泛存在于水處理系統(tǒng)中。

關(guān)于AOB與全程硝化菌對于氨氮的競爭，雖然全程硝化菌的氨氧化路徑相比AOB產(chǎn)能更多，但是AOB可以迅速將氨氮轉(zhuǎn)化，速率更快。通過模型模擬AOB與全程硝化菌在3種環(huán)境中的競爭，發(fā)現(xiàn)全程硝化菌相比AOB，對于氨氮的競爭并沒有優(yōu)勢，而AOB生物量有大于全程硝化菌生物量的趨勢，可能只有在低氨氮濃度的條件下，全程硝化菌的產(chǎn)能優(yōu)勢才會更為顯著[40]。實(shí)際的條件可能更為復(fù)雜，還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

全程硝化菌的發(fā)現(xiàn)完善了硝化的版圖，解決了長久以來硝化理論中存在的問題，對于硝化微生物(AOA、AOB、NOB和全程硝化菌)中生態(tài)位的劃分也提出了新的問題，許多硝化系統(tǒng)中實(shí)際作用的硝化菌也需要進(jìn)一步確定。

3 展望

NOB作為生物圈中氮循環(huán)的主要參與者，種類繁多，豐富的基因決定了其可以適應(yīng)各種不同的環(huán)境，所以分布廣泛。NOB的進(jìn)化差異導(dǎo)致了NXR的不同，Nitrospira的NXR與厭氧氨氧化菌的NXR的關(guān)系很可能是水平基因轉(zhuǎn)移的結(jié)果，這種差異表現(xiàn)在與亞硝氮底物的親和力上產(chǎn)生了r/K型菌的區(qū)別。NOB并不僅是一類專性亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，對其生態(tài)位的認(rèn)識也不應(yīng)局限于此，其具有更加多樣化的營養(yǎng)方式，通過與包括AOB/AOA在內(nèi)的各種微生物互相作用，來適應(yīng)各種條件，在不同的環(huán)境中具有不同的生態(tài)位，這也是其分布廣泛的重要原因。未來對于NOB的研究不應(yīng)僅局限于AOB-NOB體系，應(yīng)該從更加全面、多元的角度分析研究，以期做出更大的突破。

AOA/AOB-NOB以及全程硝化菌共同作用于硝化階段，各種微生物間的協(xié)同競爭更為多樣，硝化微生物中生態(tài)位的劃分也更加多元。研究單因素及多因素對于這種新體系的影響，會對污水處理工藝實(shí)現(xiàn)高效的短程硝化反硝化與厭氧氨氧化產(chǎn)生實(shí)際的意義。污水處理系統(tǒng)等許多人工系統(tǒng)中的AOBNOB體系可能需要重新評估。鑒于全程硝化菌的存在，可能許多系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的NOB實(shí)際上是全程硝化菌，其同樣起到了AOB的氨氧化作用。相比其他NOB與AOB的協(xié)同作用，全程硝化菌與AOB間存在明顯的競爭，兩者的競爭關(guān)系可能比模擬的情況更加復(fù)雜，還需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。