何沛敏，童 欣，李冠武

（汕頭大學醫(yī)學院腫瘤分子生物學開放實驗室，廣東 汕頭 515041）

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是死亡率最高，對人類健康威脅最大的惡性腫瘤，其目前的5年生存率只有18.2%.根據(jù)組織學特征，肺癌中約85%屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）.在臨床上，由于缺乏早期發(fā)現(xiàn)的有效手段，大部分非小細胞肺癌患者被確診時已處于晚期，不能進行手術(shù)切除，只能選擇放療和化療，但效果不理想.近年來，在深入了解腫瘤發(fā)生的分子機制基礎(chǔ)上產(chǎn)生的靶向治療越來越受到重視.對比于傳統(tǒng)的化療和放療，靶向治療對腫瘤細胞更有針對性，具有副作用少、毒性低等優(yōu)勢.目前，針對晚期NSCLC 最成熟的靶向治療點有表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、棘皮動物微管結(jié)合蛋白4（echinoderm micmtubule associated protein hke 4，EML4）和間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因.而表皮生長因子受體- 酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）就是針對表皮生長因子受體（EGFR）敏感突變的NSCLC 患者，臨床上治療效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的放化療.故對攜有EGFR 基因敏感突變的晚期NSCLC 患者，靶向類藥物EGFR-TKI 是首選治療方案，特別是不吸煙的亞裔女性肺腺癌患者.EGFR-TKI 的一線治療藥物有吉非替尼（gefitinib）等，而厄洛替尼（erlotinib）和埃克替尼（icotinib）等可作為二、三線治療的藥物.

然而經(jīng)過一段時間治療后，患者易對EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性，耐藥的產(chǎn)生極大地限制了靶向治療的發(fā)展.有研究表明獲得性耐藥的產(chǎn)生主要跟EGFR-TKI 誘導的自噬（autophagy）活性增強有關(guān).所以，克服EGFR-TKI 的耐藥性，要先了解自噬對耐藥形成的作用，并針對地干預腫瘤細胞的自噬活性來延緩耐藥形成，尋找和發(fā)現(xiàn)相關(guān)藥物（例如自噬誘導劑或抑制劑）來拮抗EGFR-TKI 的耐藥性.解決EGFR-TKI 的耐藥問題是一個艱辛而有意義的科研任務(wù)，研究者可以從自噬誘導或抑制層面獲得啟發(fā)，尋找能拮抗靶向藥EGFR-TKI 耐藥的方法.本文基于EGFR-TKI 在非小細胞肺癌治療中的作用機制、其耐藥機制及可用自噬調(diào)節(jié)劑逆轉(zhuǎn)耐藥性方面作如下綜述.

1 EGFR、自噬與EGFR-TKI的作用機制

EGFR 基因位于人類7 號染色體短臂的12-14 區(qū)，包含28 個外顯子，其中18～24外顯子可以編碼該受體的酪氨酸激酶部分.但超過90%的EGFR 突變是發(fā)生在19～21外顯子，尤其是19 外顯子，約占所有突變的60%.而外顯子19 堿基缺失和外顯子21的點突變往往是對EGFR-TKI 治療敏感的.突變后EGFR 可不依賴表皮生長因子EGF，進行自激活，活性增強.EGFR 作為一種酪氨酸蛋白激酶受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后激活酪氨酸激酶（TK），使其磷酸化，激活下游的P13K-Akt-mTOR 通路和SOS-Ras-RAFMEK-MAPK 通路等使自噬減少，同時加速分泌轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor，TGF）、IL-8、Bfgf 和VEGF 等來促進腫瘤生長，使腫瘤細胞獲得不死性，進入“瘋長- 分裂”的惡性循環(huán)模式.所以，EGFR 的過表達或活性增強（突變后）會使得細胞生長加快，自噬受到抑制，導致腫瘤的產(chǎn)生.而靶向藥物EGFR-TKI 正是靶向瞄準EGFR 的酪氨酸激酶胞內(nèi)區(qū)，使其活性減弱，增加自噬，達到治療目的.

自噬是細胞在自噬相關(guān)基因（Autophagy associated genes，ATGs）的精密調(diào)控下，通過迅速批量分解細胞器和蛋白等細胞內(nèi)容物以實現(xiàn)物質(zhì)重新利用，提高在缺氧、饑餓、化療和靶向藥物存在等的不利環(huán)境下存活的一種手段[1].在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬起著雙刃劍作用.一方面，自噬可以作為人體的自我保護機制，通過清除受損的細胞器，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保護細胞正常生長，并在腫瘤細胞產(chǎn)生后經(jīng)自噬性細胞死亡等抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，自噬可以作為腫瘤細胞生長過程中的一種自我保護反應(yīng)，在處于缺氧、饑餓、靶向藥EGFR-TKI 等不利環(huán)境中時，腫瘤細胞通過快速上調(diào)自噬水平，分解無用或不急需的蛋白質(zhì)和細胞器，減慢生長速度，降低消耗，適應(yīng)改變，這也是EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性的重要原因.

EGFR-TKI 通過可與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）競爭地結(jié)合EGFR 的酪氨酸激酶，也可作為酪氨酸的類似物，阻斷酪氨酸激酶的活性，阻止EGFR 磷酸化，進而通過其下游的蛋白激酶B（proteinase B，PKB，又稱AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactived protein kinase，MAPK）途徑，阻斷EGFR 信號通路，抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移.

2 EGFR-TKI耐藥的分子機制

2.1 EGFR的T790M基因二次突變

在獲得性耐藥機制中，約50%病例發(fā)生T790M 基因突變，減弱了EGFR-TKI 對腫瘤細胞的殺傷作用.EGFR 基因20 外顯子的T790M 發(fā)生堿基C-T 替換，導致EGFR 中原本的蘇氨酸（T）被占位較大的蛋氨酸（M）取代，形成空間位阻，恢復激酶區(qū)，使與ATP 的親和力增加[2].另外，作為管家基因的第790 位密碼子，在調(diào)節(jié)ATP 結(jié)構(gòu)域特異性抑制劑方面起重要作用，而這種突變會使得已有L858R 突變的激酶對ATP 的親和力更強于EGFR-TKI，從而競爭性抑制了EGFR-TKI 與突變區(qū)域的結(jié)合，減少了EGFR-TKI 對下游信號傳導的阻斷，產(chǎn)生EGFR-TKI 的獲得性耐藥[3].但關(guān)于T790M 基因突變還有另一種說法是選擇性模式，即T790M 突變耐藥克隆原本就存在腫瘤組織中，經(jīng)EGFR-TKI 的篩選治療后敏感的克隆被殺滅，而含有T790M 突變的耐藥克隆部分得以存活下來，使腫瘤整體上呈現(xiàn)耐藥性[4].

2.2 C-Met基因擴增

約有5%-20%的獲得性耐藥是由c-Met基因擴增造成的[5].c-Met基因擴增會使肺癌細胞繞開EGFR 這一靶點，通過增多的C-Met 蛋白跨膜受體與ErbB3 的結(jié)合，使下游的P13K/AKT 信號通路增強，促進腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，同時抑制自噬，從而降低對EGFR-TKI 的敏感性.

2.3 表型轉(zhuǎn)變

Sequist 等人發(fā)現(xiàn)有14%原本對EGFR-TKI 反應(yīng)良好的NSCLC 晚期患者發(fā)生耐藥是由于轉(zhuǎn)化為了小細胞肺癌SCLC[6].而40%耐藥病人會出現(xiàn)上皮細胞化生為間質(zhì)細胞，即上皮細胞間質(zhì)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），從而形成腫瘤干細胞，降低了EGFR 信號的依賴性.然而，NSCLC 患者對EGFR-TKI 耐藥，不僅是因為獲得性耐藥，還有一部分是自始至終就對EGFR-TKI 不敏感，即原發(fā)性耐藥.一方面，沒有對EGFR 基因敏感突變的NSCLC 患者對EGFR-TKI 天然不敏感；另一方面，即使對EGFR 敏感突變的患者，仍有20%-30%的患者對EGFR-TKI 原發(fā)性耐藥，如EGFR 基因20 外顯子和18外顯子的突變、BIM多態(tài)性缺失、K-ras 基因突變、EML4-ALK 融合基因突變、PTEN 抑癌基因缺失等.

EGFR-TKI的獲得性耐藥機制除了有以上的T790M基因二次突變、C-Met基因擴增和細胞表型從非細胞細胞肺癌轉(zhuǎn)化為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）[7].相對少見的機制還有HER2 擴增[8]、胰島素樣生長因子-1 受體、BRAF 突變和MAK 擴增.

3 TKI耐藥后的應(yīng)對策略

由于EGFR-TKI 耐藥的機制很多，目前針對EGFR-TKI 耐藥還沒有一個標準的治療方案.T790M 突變是EGFR-TKI 最常見的耐藥機制，而突變后腫瘤細胞的增殖仍依賴EGFR 信號傳導通路，因此阻斷EGFR 信號傳導通路是逆轉(zhuǎn)耐藥性的重要環(huán)節(jié)，目前相關(guān)的研究有EGFR-TKI 聯(lián)合EGFR 西妥昔單抗、不可逆的HER-TKI 抑制劑、EGFR-TKI與c-Met 抑制劑聯(lián)合、T790M 突變特異性抑制劑及熱休克蛋白90 抑制劑（CH5164840）.其中針對T790M 突變的特異性抑制劑有雷帕霉素、AP26113、C0-1686、WZ4002 等.目前也有研究表明CH5164840 聯(lián)合使用厄洛替尼，可以較好的緩解厄洛替尼耐藥.針對HGF/MET 信號通路研究藥物也是靶向治療研究的一個熱點，根據(jù)抑制的傳導水平不同，可分為兩種：一種是在HGFR 的配體或受體水平阻斷該信號通路，代表藥有：抗HGF 的單抗（AMG-102 和AV-29 9）和抗HGFR 單抗（Met Mab）[9].另有一種是通過抑制MET 酪氨酸激酶區(qū)進而抑制該通路即MET-TKI：Foretinib（XL880）、Tivantinib（ARQ 197）和Cabozantinib（XL184）[10].另外，Xuan Xianglan 等試驗證實c-MET 抑制劑（SU11274）聯(lián)合EGFR-TKI 類藥物吉非替尼或厄洛替尼可通過抑制EGFR 信號通路，進而有效抑制EGFR-TKI 耐藥的肺癌細胞增殖并促進其凋亡[11].目前c-MET 抑制劑及MET 單克隆抗體如apmatinib（ICN280）聯(lián)合吉非替尼、Emibetuzumab（LY2875358）[12]聯(lián)合厄洛替尼的臨床試驗正在進行中.

4 通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞自噬，可以延緩TKI耐藥

自噬在腫瘤的治療中也是起著雙刃劍的作用.一方面，腫瘤細胞由于自我保護反應(yīng)引起的自噬會促進EGFR-TKI 耐藥的形成，近年來研究證實高水平的自噬可以幫助腫瘤細胞在EGFR-TKIs 治療中存活下來[13]，此時抑制自噬可有效地降低耐藥性，增加EGFR-TKI 的細胞毒性作用，提高治療效果.但另一方面，也有研究表明，在治療過程中，自噬可介導細胞發(fā)生自噬性死亡，這種情況下，可通過誘導自噬，提高EGFR-TKI 治療效果.由于細胞信號通路網(wǎng)的復雜性，一條通路的抑制會使得細胞另外的通路調(diào)節(jié)性增強，以及細胞本身突變的多樣性，不同患者的癌細胞所處的狀態(tài)不同以及耐藥機制不同，使得促進自噬還是抑制自噬才能起著殺滅癌細胞作用，需要針對個體分別處理.這些研究為治療輔助藥物的研發(fā)提供了方向，根據(jù)不同情況聯(lián)合使用自噬誘導劑或抑制劑調(diào)節(jié)自噬水平，是一個很有希望克服EGFR-TKI 耐藥，提高治療效果的新型治療方案.

4.1 聯(lián)合使用自噬誘導劑

聯(lián)合使用自噬誘導劑，通過誘導細胞發(fā)生自噬性死亡，從而來提高EGFR-TKI 的治療效果.基于P53 基因多態(tài)性與NSCLC 患者的耐藥性形成的研究，Yaara Gorzalczany 等發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI 類藥物厄洛替尼聯(lián)合使用自噬誘導劑雷帕霉素可利于提高NSCLC 患者對EGFR-TKI 的反應(yīng)[14].Eun Ju Kim 等也發(fā)現(xiàn)mTOR 抑制劑（依維莫司everolimus/RAD001和雷帕霉素rapamycin）通過誘導自噬，使得PTEN 缺失的非小細胞肺癌細胞重獲對靶向治療藥EGFR-TKI 和放射治療的敏感[15].最近Kenneth K.W.To 等的研究表明PPARγ 激動劑可通過誘導ATG5 基因沉默的PTEN 缺失細胞的自噬性細胞死亡，進而有助于減緩耐藥性.因此，PPARγ 激動劑（羅格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、替米沙坦telmisartan）和EGFR-TKIs 聯(lián)合使用可作為一種新型的治療手段，用以規(guī)避由于PTEN 缺失產(chǎn)生的EGFR-TKI 耐藥[16].

然而Yongjie Wei 等認為目前有關(guān)用自噬誘導劑拮抗EGFR-TKI 耐藥性的實驗有一定的局限性，缺乏說服力，因為他們實驗用的是EGFR 高表達細胞株，而不是對EGFR-TKI 敏感的EGFR 突變細胞，由于需要足夠多的藥量才可誘導自噬的發(fā)生，所以對比臨床用藥，實驗中誘導劑的用量多，這些實驗都是基于線粒體活動，只反映了細胞增殖和死亡，而不是說明細胞生存中自噬的作用，還缺乏體內(nèi)實驗的支持[17].

4.2 聯(lián)合使用自噬抑制劑

與前述通過誘導細胞自噬，抑制EGFR-TKI 耐藥相反，Yuan-yuan Li 發(fā)現(xiàn)在對Erlotinib 敏感的NSCLC 細胞中自噬水平被誘導，抑制自噬誘導凋亡可以進一步增強對EGFR 突變（外顯子19 缺失）的NSCLC 中erlotinib 的敏感性，提示通過抑制自噬以提高細胞對EGFR-TKI 的敏感性，可解決獲得性耐藥的問題[18].該研究也說明使用自噬誘導劑或抑制劑取決于是否存在EGFR 突變.

來自加州大學的Jasmine G.Lee 和Reen Wu 等研究發(fā)現(xiàn)：在使用厄洛替尼的基礎(chǔ)上，加用自噬抑制劑—順鉑，可通過靶向下調(diào)Atg3 介導的自噬和誘導凋亡來抵抗厄洛替尼的耐藥形成[19].除此之外，Zou 等人聯(lián)合使用另外一種自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）或羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）也可以達到抑制腫瘤生長，加強厄洛替尼的腫瘤細胞殺傷作用.他們進一步的分析發(fā)現(xiàn)其凋亡水平明顯提高，但細胞周期和EGFR 下游信號通路活性沒有明顯的改變[20].2017年，Xiangxiang Hu 等聲明Akt/mTOR 和Erk 信號通路與二代EGFR-TKI 藥阿法替尼（afatinib）引起的自噬有關(guān)，聯(lián)合使用該通路的抑制劑氯喹和3- 甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可有效阻斷自噬，很有希望用于作為EGFR 突變激活肺腺癌個體耐藥和提高對afatinib 敏感性的新策略[21].

5 治療NSCLC的潛在新藥或輔助藥物

近年來，不斷有新的自噬誘導劑被發(fā)現(xiàn)，并用于治療非小細胞肺癌的研究，其中相當一部分的研究靶點是針對肺癌細胞的PI3K/AKT/mTOR 通路.2015年，Ruolin Zhao等認為他們的實驗首次證明了桔梗皂苷-D（Platycodin-D）可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，激活JNK 和p38 MAPK 信號通路來誘導自噬，并因此推斷桔梗皂苷-D可成為非小細胞肺癌的替代治療藥物，但其具體作用機制和抗癌效果還沒完全研究清楚[22].在miR-16 mimics 可作為一種自噬誘導劑，增強喜樹堿等抗癌藥的抗癌效果的基礎(chǔ)上，Hui Wang等驗證了miR-16 mimics 靶向結(jié)合耐藥肺癌細胞內(nèi)高表達的ATG3，激活自噬，抑制了TGF-β1 介導的EMT，減緩NSCLC 中的癌細胞轉(zhuǎn)移[23].另外，Aili Wang等表示姜黃素（Curcumin）也可作為mTOR 的抑制物，可抑制PI3K/mTOR 通路的活性，從而誘導細胞自噬，抑制非小細胞肺癌的發(fā)展，但其研究缺乏體內(nèi)研究和臨床效用調(diào)查[24].

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)某些化合物也可作為克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐藥性的輔助藥物.Teng Zhao 等認為藤黃酸（Gambogic acid）可在癌細胞已形成抗凋亡的情況下，促進細胞自噬性死亡，因此可作為非小細胞肺癌患者的一種輔助治療手段[25].而Hengyi Chen 等研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用二甲雙胍和伏立諾他可以通過誘導BIM 依賴的凋亡來克服EGFR-TKI 耐藥，有待成為一個新的克服EGFR-TKI 耐藥的方向[26].此外，Hyungmin Jeong 等通過體外系統(tǒng)篩選實驗發(fā)現(xiàn)從蔬菜，水果提取的多酚類化合物（包括兒茶酚水合物、咖啡酸、白藜蘆醇等）在克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐藥性方面具有潛在的有效作用，可作為長期EGFR-TKI 治療肺癌病人的輔助藥物[27].其中，Michael Yousef等通過總結(jié)目前的體外和體內(nèi)實驗結(jié)果，表明白藜蘆醇可以抑制癌細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡，有很好的抗癌作用[28].然而，對于多酚類化合物在非小細胞肺癌的EGFR-TKI 耐藥中的治療作用和拮抗EGFR-TKI耐藥的分子機制仍未得到充分研究.

與正常細胞相比，腫瘤細胞主要進行無氧酵解，因此需要消耗的葡萄糖更多，而有研究證明，多重耐藥腫瘤細胞會過表達與糖酵解有關(guān)的蛋白，更加依賴糖酵解存活.而低氧或葡萄糖缺乏的情況下，自噬會增加.利用這一點，Mingtong Ye 等用實驗證明，erlotinib 耐藥的肺癌細胞ER1-6 比敏感的肺癌細胞更依賴無氧酵解，提出抑制糖酵解可以克服EGFR-TKI 耐藥性，可在AKT 或自噬通路抑制劑的基礎(chǔ)上進行氧氣或葡萄糖剝奪可能作為新型的抵抗肺癌的EGFR-TKI 獲得性耐藥性方案的解決方法[29].

6 針對耐藥機制開發(fā)的新藥

最近有研究表明設(shè)計一個納米顆粒的藥物輸送系統(tǒng)- 多重耐藥基因1 抗體修飾的幾丁聚糖納米粒子（mAb MDR1-modified chitosan nanoparticles）來運載吉非替尼抗癌藥和自噬抑制劑氯喹，同時通過阻斷MDR1 受體，可以達到克服耐藥的目的.這種新方法既加強了抗癌藥和自噬調(diào)節(jié)劑的傳遞，使靶向治療定位更準確，同時可以抑制多重耐藥受體活性，使治療效果更明顯，是個重要的拮抗EGFR-TKI 耐藥的輔助策略[30].

通過對分子機制的研究，Yosuke Togashi，MD 等研究發(fā)現(xiàn)EGFR 突變的NSCLC細胞會出現(xiàn)較高表達水平的β-Catenin.應(yīng)用β-Catenin 抑制劑XAV939 可以抑制與EGFR-TKI 耐藥形成相關(guān)的腫瘤干細胞的特性，增強EGFR-TKIs 在EGFR 突變的NSCLC 細胞系中的敏感性，提示β-Catenin 可能成為攜帶T790M 突變的NSCLC 新的治療靶點.

7 總結(jié)與展望

綜上所述，不同的NSCLC 患者患肺癌的分子機制不盡相同，EGFR-TKI 耐藥的機制也有所不同，但均與腫瘤細胞的自噬活動密切相關(guān)，因此通過分子檢查手段，深入到患者個體的耐藥機制，應(yīng)用相關(guān)自噬抑制劑或誘導劑來拮抗EGFR-TKI 的耐藥性，才可以提高治療效果，避免盲目用藥.但目前許多關(guān)于抗非小細胞肺癌藥物的研究，其分子機制還不是很明確，是通過自噬影響腫瘤還是其他機制（例如凋亡），這方面的缺陷就還需研究者去填補，并建立有關(guān)數(shù)據(jù)庫，及時收錄和更新目前NSCLC 的藥物研究和新致癌基因、新通路數(shù)據(jù)，為研究者提供新的思路.臨床上，由于細胞信號通路的復雜性，抑制了腫瘤的某些信號通路，另一些通路卻代償性上調(diào).因此，抑制信號通路的靶向治療應(yīng)該是多靶點聯(lián)合用藥，效果可能會更好.尤其是長期用藥患者，聯(lián)合用藥可降低耐藥性.但耐藥后的治療目前仍沒有標準的治療方案，對各種不同耐藥機制的病人實現(xiàn)個體化治療將是最有效的治療手段.