金磊磊 李澤坤 金慧 朱星揚(yáng) 張保錢 蔣海俠 陳集雙

摘要：為建立梔子愈傷組織的間隙浸沒植物生物反應(yīng)器高通量培養(yǎng)體系，同時探討誘導(dǎo)劑對梔子愈傷組織中藏紅花素合成的影響。以MS+2.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L 萘乙酸（NAA）+30 g/L蔗糖為增殖培養(yǎng)基，在40 d的培養(yǎng)時期內(nèi)，梔子愈傷組織在植物生物反應(yīng)器中生長狀況良好，增殖系數(shù)呈升高趨勢。對不同培養(yǎng)時間（20、30、40 d）和添加誘導(dǎo)劑處理的梔子愈傷組織中的藏紅花素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，梔子愈傷組織中的藏紅花素含量顯著提高，在培養(yǎng)40 d時達(dá)到了0.206 5 mg/g;添加CuSO4和茉莉酸甲酯（MeJA）促進(jìn)了梔子愈傷組織中藏紅花素的合成，單位質(zhì)量梔子愈傷中的藏紅花素含量顯著增加，培養(yǎng)30 d時達(dá)到0.372 3 mg/g。

關(guān)鍵詞：梔子;愈傷組織;藏紅花素;植物生物反應(yīng)器;誘導(dǎo)劑

中圖分類號：S567.04 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0042-05

收稿日期：2021-05-16

基金項目：江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心項目（編號：XTD1825）;國家自然科學(xué)基金（編號：31560079）。

作者簡介：金磊磊（1987—），男，浙江東陽人，碩士，實驗師，從事植物細(xì)胞工程、藥用植物天然產(chǎn)物開發(fā)方面的研究。 E-mail：jinleilei2011@163.com。

通信作者：陳集雙，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事生物資源學(xué)研究。E-mail：biochenjs@njtech.edu.cn。

梔子（Gardenia jasminoides Ellis.），別稱黃梔子、山梔子、林蘭等，屬于茜草科梔子類植物，梔子花是衛(wèi)生部頒布的第1批藥食兩用資源。梔子作為傳統(tǒng)中藥，具有護(hù)肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用[1]。梔子含有黃酮類、有機(jī)酸酯類、多糖類、醛類、醇類、長鏈烷烴類等化合物成分，其中梔子果實中主要的有效成分為藏紅花素（crocin）、藏紅花酸和梔子苷[2]。藏紅花素又名西紅花苷，主要來源于藏紅花的成熟花絲中，是藏紅花的有色成分且是主要成分[3]。研究表明，藏紅花素具有降血脂、抗腫瘤等功效。由于藏紅花以柱頭入藥，且藏紅花適宜種植區(qū)域有限，高品質(zhì)的藏紅花資源短缺，年產(chǎn)量極低。梔子繁殖以扦插和實生苗種植為主，現(xiàn)有資源量大，可作為制備藏紅花素的植物資源。

不同品種和產(chǎn)地梔子果中藏紅花含量不同，目前報道的梔子果中藏紅花素含量均在1%以內(nèi)[4-8]。石鳳鳴等發(fā)現(xiàn)隨著梔子果實的成熟，藏紅花素的含量顯著增加[9]。付小梅等通過研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素在pH值為6.0～7.0之間最穩(wěn)定并且光照、溫度均能影響其穩(wěn)定性[10]。陳雁等利用高效液相色譜（HPLC）法測定了不同產(chǎn)地梔子中的藏紅花素含量，其中江西吉安的梔子果實的藏紅花素含量最高，達(dá)到了0.68%[11]。據(jù)研究報道，梔子的愈傷組織中也存在微量的藏紅花素。陳書安等對產(chǎn)藏紅花素的梔子愈傷組織進(jìn)行了誘導(dǎo)和篩選，從而篩選出產(chǎn)藏紅花素的梔子細(xì)胞系，其中1個細(xì)胞系的藏紅花素含量達(dá)0.348 mg/g[12]。

筆者所在課題組自主開發(fā)了用于植物高通量繁育的間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器，前期研究表明，該系統(tǒng)有利于帶塊莖（鱗莖）的植物繁殖體、植物愈傷組織、蘭科植物原球莖等的增殖擴(kuò)繁，在白芨、半夏、金釵石斛等藥用植物種苗和組織器官的繁育上取得了較好的應(yīng)用效果[13-15]。本研究基于植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)，以期建立梔子愈傷的高通量增殖體系，并探索通過植物生物反應(yīng)器持續(xù)生產(chǎn)梔子愈傷、產(chǎn)藏紅花素的優(yōu)化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月，選取固體組培瓶中培養(yǎng)30 d 的山梔子愈傷組織作為增殖材料，開展植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系研究及藏紅花素含量檢測。梔子果實為購買的藥用山梔子果實。本試驗在南京工業(yè)大學(xué)生物資源工程研究所開展。

1.2 植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)

取30 d固體預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織15 g，轉(zhuǎn)接至含有1 000 mL液體培養(yǎng)基的植物生物反應(yīng)器內(nèi)，于 24 ℃ 下進(jìn)行暗培養(yǎng)，間歇浸沒頻率為3 min/4 h。液體培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）+30 g/L蔗糖，pH值為5.8。在培養(yǎng)基中添加CuSO4、 茉莉酸甲酯（MeJA）進(jìn)行藏紅花素合成誘導(dǎo)試驗，設(shè)置2種添加方式：500 μmol/L CuSO4、500 μmol/L CuSO4+100 μmol/L MeJA，處理組和空白對照均重復(fù)接種3個植物生物反應(yīng)器。

1.3 梔子愈傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

將植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)30 d的愈傷組織放入1%的NaCl溶液中，于120 r/min、28 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2 d。取少量愈傷組織細(xì)胞用中性紅染色，放于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 梔子愈傷增殖系數(shù)的測定

梔子愈傷在反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d后，觀察其生長情況并統(tǒng)計分析。用分析天平稱量梔子愈傷的鮮質(zhì)量。梔子愈傷增殖系數(shù)的測定公式：

梔子愈傷增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后梔子愈傷的鮮質(zhì)量-轉(zhuǎn)接時梔子愈傷的鮮質(zhì)量轉(zhuǎn)接時梔子愈傷的鮮質(zhì)量。

1.5 藏紅花素的提取

將不同培養(yǎng)處理的梔子愈傷組織以及梔子果實樣品置于60 ℃恒溫烘箱中5～6 h 至恒質(zhì)量后研磨得粉末。稱取粉末樣品1 g，用50%甲醇稀釋倒入50 mL離心管中，超聲破碎30 min。再放入振蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩提取2 h，3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液。向離心沉淀物中加入10 mL 50%的甲醇，繼續(xù)再振蕩提取1 h，離心后再次回收上清液。將2次上清液合并，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，50%甲醇（色譜級）溶解浸膏，定容至10 mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 藏紅花素的檢測

液相色譜檢測前，將50%甲醇溶解的樣品通過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。

1.6.1 液相色譜條件的選擇

色譜柱選用Innoval AQ C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流速設(shè)置為0.7 mL/min;檢測波長為440 nm;柱溫為25 ℃;流動相：甲醇與水體積比為53 ∶47;進(jìn)樣量為10 μL。

1.6.2 液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用分析天平精密稱取藏紅花素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，用50%甲醇稀釋配成0.5 mg/mL藏紅花素標(biāo)準(zhǔn)品母液。取藏紅花素標(biāo)準(zhǔn)品母液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL至5 mL容量瓶中，配成濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。檢測時進(jìn)樣 10 μL，重復(fù)3次，測定完后，建立和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程（橫縱坐標(biāo)分別為溶液濃度和出峰面積）。

1.6.3 數(shù)據(jù)分析

取處理好的梔子愈傷樣品和對照樣品按照“1.6.1”節(jié)中設(shè)定的液相色譜條件進(jìn)行檢測，并按照“1.6.2”節(jié)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將與標(biāo)準(zhǔn)品同一出峰時間的峰面積換算成甲醇溶解液中的藏紅花素含量，再根據(jù)以下公式，計算得到樣品和對照品中的藏紅花素含量。A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算到的濃度（mg/mL），粉末質(zhì)量為1 g梔子愈傷干質(zhì)量。

樣品中藏紅花素含量（mg/g）=A×10 mL甲醇定容體積1 g梔子愈傷粉末質(zhì)量。

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子愈傷的植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系

梔子愈傷組織的質(zhì)地結(jié)構(gòu)疏松，隨著培養(yǎng)時間的增加，愈傷塊逐步增大，顏色從白色變?yōu)榈S色，與固體組培培養(yǎng)的愈傷狀態(tài)一致;梔子愈傷組織團(tuán)整體呈淡化黃色，表面較為光滑濕潤，見少量絲狀毛刺（圖1-A）。由于細(xì)胞重疊不易將其平鋪展開，遂取少量愈傷放于搖瓶培養(yǎng)將細(xì)胞分散，加入1%NaCl溶液可以讓愈傷組織失水，以便觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在光學(xué)顯微鏡下，單個愈傷細(xì)胞呈長條狀，中間無隔膜，細(xì)胞壁較薄（圖1-B）。

從增殖系數(shù)來看（表1），不添加CuSO4，當(dāng)培養(yǎng)時間為40 d時，增殖系數(shù)達(dá)到1.902。培養(yǎng)20 d時，增殖系數(shù)最低，為1.175。由此可知，在40 d的培養(yǎng)時期內(nèi)，梔子愈傷組織在植物生物反應(yīng)器中增殖狀態(tài)良好，且仍有繼續(xù)增殖的趨勢（圖2-A、圖2-B）。

添加CuSO4和MeJA后，在植物生物反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d梔子愈傷細(xì)胞團(tuán)顏色基本呈褐色（圖2-C、圖2-D），愈傷細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量比對照培養(yǎng)組少，愈傷組織增殖緩慢。添加500 μmol/L CuSO4的梔子愈傷增殖系數(shù)為0.487，添加2種誘導(dǎo)劑的梔子愈傷增殖系數(shù)為0.348（表1）。由此可知，添加一定濃度的MeJA、CuSO4對梔子愈傷的生長具有抑制作用，不利于愈傷組織的增殖。

2.2 產(chǎn)藏紅花素培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 藏紅花素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)不同濃度藏紅花標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測峰圖數(shù)據(jù)，繪制藏紅花素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），并得到計算公式：y=64 584.0x-1 407.9，r2=0.998 1。其中，y為峰面積，mAu·s;x為藏紅花素含量，mg/mL。

2.2.2 不同處理梔子愈傷組織中的藏紅花素含量

試驗中發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)30 d和反應(yīng)器培養(yǎng)20 d的樣品峰面積太小，含量達(dá)不到檢測下限。除此之外，梔子果實、植物生物反應(yīng)器中培養(yǎng)30、40 d，以及添加CuSO4和MeJA后培養(yǎng)30 d的梔子愈傷的提取物中均有明顯的藏紅花素檢測峰。本試驗中藏紅花素的出峰時間為（4.4±0.1） min（圖3）。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算進(jìn)樣樣品中藏紅花素含量，并利用“2.2.1”節(jié)中的計算公式換算各個樣品中藏紅花素的質(zhì)量濃度。不同樣品中的藏紅花素含量見表2。

由表2可知，梔子果實中的藏紅花素含量為6.74 mg/g，與相關(guān)研究報道的梔子果實中藏紅花素含量[9]基本一致。植物生物反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d的愈傷組織中藏紅花素含量為0.145 4 mg/g，40 d為0.206 5 mg/g，二者間差異顯著（圖4）。添加誘導(dǎo)劑處理后，藏紅花素含量顯著增加，其中添加CuSO4處理后藏紅花素含量為0.350 9 mg/g，2種誘導(dǎo)劑組合處理為0.373 2 mg/g（表2），相較不添加誘導(dǎo)劑的處理中藏紅花素含量差異顯著。由此可得，誘導(dǎo)劑的添加能顯著提高梔子愈傷中藏紅花的含量。

3 討論與結(jié)論

本試驗建立了梔子愈傷的植物生物反應(yīng)器高通量擴(kuò)繁體系，并分析了不同培養(yǎng)時間（20、30、40 d）和誘導(dǎo)劑處理的梔子愈傷組織中的藏紅花素含量。以固體組培瓶中培養(yǎng)30 d的梔子愈傷為增殖材料，在培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH值為5.8的條件下，植物生物反應(yīng)器中梔子愈傷的增殖狀態(tài)良好，增殖系數(shù)高，優(yōu)于同期的固體培養(yǎng)。同時，培養(yǎng)40 d的單質(zhì)量梔子愈傷的藏紅花素含量顯著高于培養(yǎng)20、30 d的梔子愈傷組織，表明在一定的培養(yǎng)時期內(nèi)藏紅花素含量隨愈傷的增殖而積累。誘導(dǎo)劑可促進(jìn)梔子愈傷組織中藏紅花素合成，添加CuSO4和MeJA 2種誘導(dǎo)劑時，單質(zhì)量梔子愈傷中的藏紅花素含量顯著增加，達(dá)到0.372 3 mg/g。

按照結(jié)實情況，梔子分為藥用梔子和賞花梔子。廣泛種植的賞花梔子（如重瓣梔子、大花梔子）只開花不結(jié)果;山梔子及其變種水梔子為主要的藥用梔子品種，由于栽培條件、品種資源和生產(chǎn)加工方式的制約，其栽培和利用尚未形成規(guī)模，影響了藏紅花素等活性物質(zhì)的制備和開發(fā)應(yīng)用。植物細(xì)胞工程手段為藏紅花素的快速高效生產(chǎn)提供了可行的技術(shù)方案。已有相關(guān)研究利用選育的藏紅花細(xì)胞系和梔子細(xì)胞系來制備藏紅花素[12，16]，并有研究利用固液2步法來提高梔子愈傷組織中藏紅花素的產(chǎn)量[17]。本試驗利用植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)梔子愈傷組織，表現(xiàn)了較高的增殖效率，且培養(yǎng)周期短，不受土地、環(huán)境、季節(jié)的影響，具備生產(chǎn)藏紅花素的潛力。

本試驗結(jié)果表明，梔子愈傷中藏紅花素含量明顯低于梔子果實中的含量;添加誘導(dǎo)劑在一定程度上抑制了愈傷組織的增殖，實際每罐植物生物反應(yīng)器的梔子愈傷產(chǎn)量較低，影響了藏紅花素收率。后續(xù)試驗將根據(jù)反應(yīng)器中梔子愈傷的生長狀態(tài)和藏紅花素含量積累規(guī)律，重點研究植物生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件優(yōu)化，如生長激素濃度、誘導(dǎo)劑組合和誘導(dǎo)劑添加時間等，探討梔子愈傷組織在植物生物反應(yīng)器中的有效培養(yǎng)周期以及藏紅花素的有效積累時間，以期建立持續(xù)制備藏紅花素的高產(chǎn)體系。

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