池彬彬 倪瑩 陳慧英 劉紅艷

摘要：從海拔2 500～3 000 m處的鹽井土壤樣品中分離得到1株中度嗜鹽菌，通過對該菌株的菌落形態(tài)觀察、rDNA-ITS測序及同源序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定該菌株為曲霉屬（Aspergillus），命名為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus） GLUT-01。該菌株能在3%～15% NaCl （最適7%）、20～30 ℃ （最適27 ℃）、pH值為4.0～10.0 （最適pH值為7.0）條件下生長，且能以部分污染物作為唯一碳源生長，這顯示了一定的應用潛力。以其作為發(fā)酵真菌進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，通過正交試驗分析，在接種量為2%， 溫度為28 ℃，起始pH值為6，C/N為1 ∶2條件下培養(yǎng)3～5 d，產(chǎn)生的果膠酶活性達到126.68 U/mL。試驗結果豐富了嗜鹽果膠酶的研究和開發(fā)依據(jù)，為高鹽環(huán)境下食品工業(yè)加工提供了理論基礎。

關鍵詞：中度嗜鹽菌;曲霉屬;系統(tǒng)發(fā)育樹;果膠酶;正交試驗;產(chǎn)酶條件優(yōu)化

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0239-08

收稿日期：2021-04-12

基金項目：國家自然科學基金（編號：21762015、31860251）;桂林理工大學科研啟動基金（編號：GLUT2015038）;廣西自然科學基金面上項目（編號：2020GXNSFAA238037）。

作者簡介：池彬彬（1997—），男，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向為微生物學。E-mail：837282401@qq.com。

通信作者：陳慧英，博士，副教授，主要從事微生物代謝產(chǎn)物開發(fā)，E-mail： hychen@glut.edu.cn;劉紅艷，博士，副教授，主要從事功能微生物開發(fā)及應用，E-mail： lhyglite@126.com。

自然界中存在各種各樣的鹽域環(huán)境如鹽湖、鹽井、鹽礦，也有人工合成的鹽土環(huán)境如鹽場、鹽池等，而嗜鹽菌（halophiles）則是在這樣的高鹽環(huán)境下能夠生長的一類微生物，另外鹽制發(fā)酵食品中也能夠分離篩選出嗜鹽菌[1-2]。與其他極端微生物相比，中度嗜鹽菌可以在較高濃度（3%～15%）的鹽溶液下生存[3]，并且能利用不同種類的有機物作為碳源和氮源。因其獨特的生理生化特性，確定了其在生產(chǎn)酶制劑、食品行業(yè)、污水凈化等方面具有非常廣闊的應用價值[4-5]。

果膠酶（pectinase）是世界四大酶制劑之一，是分解果膠質(zhì)酶類的總稱，主要包括原果膠酶、果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類[6]。主要來源于動植物及微生物，尤其是微生物，因其生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊等特征，成為果膠酶的重要來源[7]。目前，曲霉屬的菌株已被廣泛用于聚半乳糖醛酸酶的工業(yè)生產(chǎn)[8]。國內(nèi)果膠酶需求量很大[9]，但我國果膠酶發(fā)展速度緩慢，并且果膠酶大多都是單獨使用，這在很大程度上限制了果膠酶的應用范圍。因此，為了提高果膠酶制劑的質(zhì)量，降低成本，選擇適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)果膠酶生產(chǎn)菌是關鍵[10-11]。

目前，多數(shù)果膠酶在高濃度鹽溶液下存在酶活性較低的缺陷，限制了其更廣泛的開發(fā)利用[12-13]。因此，本試驗研究了1株中度嗜鹽真菌（GLUT-01）的形態(tài)特征、生理生化特性、分子生物學系統(tǒng)分類、培養(yǎng)條件，同時還著重對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)果膠酶條件進行探索，以期能豐富耐鹽果膠酶的基礎研究。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗時間為 2018年10月至 2019年 6月，地點為桂林理工大學（110°18′21″E， 25°04′10″N）。

1.2 材料與儀器

1.2.1 材料 菌株GLUT-01由桂林理工大學化學與生物工程學院生物工程教研室分離篩選并保存。

1.2.2 主要試劑和儀器 乳糖購自成都市科龍化工試劑廠; D-果糖、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺艷（ABTS）、聚半乳糖醛酸均購自源葉生物科技有限公司; DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn); VIS-7220N可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司生產(chǎn); iMark酶標儀，Bio-Rad Laboratoties Inc生產(chǎn); SZGMA3-30K高速冷凍離心機，SZGMA德國生產(chǎn)。

1.2.3 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基）。

種子液/發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉3.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，NaCl 28.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

改良培養(yǎng)基：磷酸氫二銨10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，KCl 20.0 g/L，MgSO4·7H2O 40.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，明膠120.0 g/L，pH值為6.8～7.0。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源（D-果糖、葡萄糖、菊糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）15.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，K2HPO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，KCl 5.00 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH值為6.8～7.0。

1.3 酶活力測定及蛋白質(zhì)含量測定

1.3.1 粗酶液的制備 將保存于PDA斜面上的菌株活化后，接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h，作為種子液使用。以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)72 h[14]。發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下冷凍離心10 min后取上清液作為粗酶液，4 ℃低溫保存。

1.3.2 果膠酶活力測定 取編號為1、2的離心管2支，各加入800 μL聚半乳糖醛酸（濃度為1%），在40 ℃水浴鍋中預熱10 min，在試管1中加入 200 μL 適當稀釋樣品酶液，在試管2中加經(jīng)煮沸 5 min 滅活的適當稀釋樣品酶液200 μL，2支試管同時放入40 ℃水浴鍋中反應20 min后，立即加入 500 μL DNS試劑停止反應，用開水煮沸顯色 5 min，立即冷卻，取反應液體200 μL于540 nm波長下測其吸光度[15]。

1.3.3 酶活單位定義 在40 ℃條件下，1 min降解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 μmol半乳糖醛酸所需酶量為1個酶活單位（U）。

1.4 形態(tài)學與生理生化鑒定

1.4.1 菌種形態(tài)觀察 將分離得到的純菌株進行劃平板培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察并記錄單菌落的顏色、形狀、透明度、大小、表面隆起和菌落培養(yǎng)基的顏色等[16]。在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)大小[17]。

1.4.2 液體培養(yǎng)形態(tài)觀察 將分離得到的純菌株接種在液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌液顏色、菌絲體形狀、菌絲體大小、透明度等。

1.5 生理生化特性試驗

1.5.1 明膠液化 接種營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，分別于1、2、3 d觀察，空管對照。觀察前先把試管放置在冰箱中20～30 min。觀察試管內(nèi)菌液是否為液態(tài)判斷其明膠液化能力。

1.5.2 甲基紅試驗 接種發(fā)酵液培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)3 d，檢測時，加入2～3 滴甲基紅試劑到培養(yǎng)液中，混勻觀察，若呈紅色，即為陽性反應，若無顏色變化，則為陰性反應[18]。

1.5.3 吲哚試驗 1%胰蛋白胨水溶液，0.5% NaCl，調(diào)節(jié)pH值為7.5，分裝小管。接種培養(yǎng)3 d后檢測。試管里加入2～3滴乙醚，再緩慢加入1～2滴吲哚試劑。乙醚層出現(xiàn)玫紅色，代表陽性，乙醚層為黃色，代表陰性[19]。

1.5.4 藥敏性試驗 將硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸土霉素、克拉霉素、硝酸益康唑、灰黃霉素分別配制成5 mg/mL抗生素溶液?？股厝芤航?jīng)紫外殺菌后，移取200 μL加入已滅菌的50 mL PDA培養(yǎng)基中，倒平板并涂布種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察并記錄結果。

1.5.5 有機污染物降解初步試驗 在改良培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，不添加任何碳氮源，以芳香類化合物作為唯一的碳源以及能量，配制培養(yǎng)基[20]。芳香類化合物為雙酚A、雙酚AF、四溴雙酚A、六溴十二烷、苯甲基磺酰氟、鄰聯(lián)甲苯胺。以2%接種量接入50 mL培養(yǎng)基，置于30 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d，觀察并記錄菌株生長情況。以不接種的培養(yǎng)基為陰性對照試驗。

1.6 rDNA-ITS的PCR擴增及測序分析

采用ITS序列設計保守擴增引物（ITS1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; ITS4： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株總 DNA 模板進行ITS1-5.8S-ITS4 rDNA 擴增， 擴增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán);72 ℃ 7 min。取4.5 μL PCR 產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，紫外燈箱觀察擴增效果。

序列測定和分析：將rDNA-ITS 擴增產(chǎn)物送交上海生工公司測序，所測序列在NBCI數(shù)據(jù)庫進行blastn同源性比對分析，利用BLAST軟件搜索相似序列后，利用MEGA 5.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）以相近序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.7 培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

采取單因素試驗設計優(yōu)化培養(yǎng)條件[22]。在 50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1 mL種子液，分別加以菊糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、乳糖為碳源，以硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨、酵母浸出粉為氮源，鹽度設為3%、5%、7%、9%、11%、15%，起始pH值梯度設為4、6、7、8、9、10、11，溫度設為4、20、27、30、37、40 ℃。均于150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，進行烘干，記錄菌體質(zhì)量，比較菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長情況。進行2個平行試驗，取均值（下同）。

1.8 培養(yǎng)條件對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

研究不同碳源、氮源、C/N、溫度、誘導劑、金屬離子、起始 pH值、接種量對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.8.1 碳源、氮源 以2%的接種量接種50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（下同），分別設置菊糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、D-果糖、乳糖為碳源，以硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨、酵母浸出粉為氮源。測定酶活，確定最佳碳源、氮源。

1.8.2 碳源、氮源添加量 在確定最佳碳源、氮源的條件下，分別設置碳源、氮源的添加量梯度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g，測定酶活，確定最佳碳源和氮源的添加量。

1.8.3 C/N 篩選出最合適的碳源、氮源后，固定碳源質(zhì)量為0.5 g，改變氮源的質(zhì)量，使得C/N分別為1 ∶10、1 ∶5、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、5 ∶1、10 ∶1，測定酶活，確定最佳C/N。

1.8.4 溫度 用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，于20、28、30、32、35 ℃條件下培養(yǎng)，測定酶活，確定最佳發(fā)酵溫度[23]。

1.8.5 誘導劑 在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中添加誘導劑，選擇麩皮（1%）、羧甲基纖維素（1%）、木質(zhì)素（1%）、苯酚（1 mmol/L）、ABTS （1 mmol/L）作為誘導劑，測定酶活，確定最佳誘導劑。

1.8.6 金屬離子 通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.25 g氯化鉻、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋇、氯化鈣、硫酸鎂，測定酶活，確定最適添加的金屬離子。選取最適金屬離子，設置添加量為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g，確定最佳金屬離子的添加量。

1.8.7 初始pH值 在以上因素為最佳條件下，調(diào)節(jié)不同pH值為 3、4、5、6、7、8進行發(fā)酵試驗，測定酶活，確定最佳初始pH值。

1.8.8 接種量 在最佳條件下，分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，測定酶活，確定最佳接種量。

1.9 正交試驗分析

各培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響確定后，考慮不同因素之間的相互作用及影響程度，對單因素確定的C/N、溫度、起始pH值、接種量進行正交試驗設計[L9（34）]，以確定最佳培養(yǎng)條件下的菌種發(fā)酵酶活。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

2.1.1 固體培養(yǎng)菌落形態(tài)

在PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后的觀察結果見圖1，菌落直徑約為8 mm，菌種生長速度較快，培養(yǎng)的第1天菌落即產(chǎn)生白色纖維狀的初生菌絲，隨著培養(yǎng)時間增加，菌絲正面轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?，反面為淡黃色。該菌種菌落生長特點與李芬芳等報道的[24]基本相同。菌絲由中心向周圍擴散生長，菌落邊緣為全緣，表面粗糙，呈粉粒狀。

菌株在顯微鏡下的觀察結果（圖2）顯示，孢子由單細胞構成，呈球狀，直徑為1～2 μm，鏈狀或堆積排列，表面光滑。

2.1.2 液體培養(yǎng)菌落形態(tài)

在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后（圖3），菌落為白色不透明的球狀，菌體直徑約為10 mm，培養(yǎng)基顏色變?yōu)橥该鳌?/p>

2.2 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株GLUT-01 的ITS1-5.8S-ITS4基因擴增條帶測序結果如下：序列總長為557 bp，序列為GACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA。

將rDNA-ITS序列在NBCI數(shù)據(jù)庫進行blastn比對分析，利用ClustalX和MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。不同的種聚為不同的分支，菌種GLUT-01與菌種Aspergillus niger CBS 172.66 NR_111412.1聚為一支，自展值為100，表明兩者親緣關系非常近。結合形態(tài)學特征及系統(tǒng)發(fā)育學分析，可以鑒定菌株GLUT-01為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）。

2.3 生理生化特性

菌株GLUT-1的生理生化特征結果見表1。該菌株在pH值為4.0～9.0時皆可生長，最適生長pH值為7.0;20～30 ℃時生長旺盛，最適生長溫度為27 ℃;鹽度為3%～9%時皆可生長， 最適生長鹽度為7%，甲基紅試驗反應為陽性，吲哚試驗反應為陰性。乳糖、葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、菊糖皆可作為碳源，可水解明膠，硫酸銨、檸檬酸氫二銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉可作為氮源。

對硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸土霉素、鹽酸林可霉素、克拉霉素、氯霉素等抗生素敏感;對硝酸益康唑、灰黃霉素2類抗生素不敏感。能夠在以雙酚A、雙酚AF、四溴雙酚A、六溴十二烷、苯甲基磺酰氟、鄰聯(lián)甲苯胺為唯一碳源和能量的培養(yǎng)基上生長。Ekanayake等也曾報道，棘孢曲霉可有效分解染料[25]。

2.4 培養(yǎng)條件對菌株發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響

2.4.1 碳源 從圖5可以看出，經(jīng)不同碳源培養(yǎng)，菊糖和D-果糖對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的影響最小，而葡萄糖可以明顯提高果膠酶的活性，乳糖次之，因此選擇葡萄糖為最適碳源。

從圖6可以看出，最佳的葡萄糖添加量為 0.5 g，此時酶活性可達到126.10 U/mL。隨著葡萄糖添加量的增加，果膠酶活性出現(xiàn)峰值之后，呈先下降再升高趨勢，但過高的葡萄糖濃度將抑制菌株生長，且依據(jù)趨勢增長最高峰依舊難以達到前峰峰值。宜選擇添加量少且效果顯著的試驗組，因此選擇 0.5 g 作為葡萄糖最佳添加量。

2.4.2 氮源 從圖7可以看出，在最佳碳源條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蛋白胨、酵母浸出粉和牛肉膏，對果膠酶活性提升不大;而硫酸銨能夠相對提高果膠酶活力，因此選擇硫酸銨作為最適氮源[26]。

從圖8可以看出，最佳硫酸銨添加量為 0.5 g，此時果膠酶活性為122.30 U/mL。隨著硫酸銨添加量的增加，果膠酶活性出現(xiàn)峰值之后呈下降趨勢。可能與硫酸銨的酸化作用有關，少量硫酸銨分解產(chǎn)生的微酸環(huán)境提高了酶活性，而過量硫酸銨導致過酸抑制了酶活和菌的生長。

2.4.3 C/N 以葡萄糖作為碳源、硫酸銨作為氮源，確定葡萄糖為0.5 g，改變硫酸銨的質(zhì)量，使得C/N分別為1 ∶10、1 ∶5、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、5 ∶1、10 ∶1，考察不同C/N對嗜鹽菌產(chǎn)果膠酶的影響，結果（圖9）顯示，1 ∶2為最佳C/N。

2.4.4 溫度 從圖10可以看出，30 ℃為最適產(chǎn)酶溫度，此時果膠酶活性達到125.88 U/mL。培養(yǎng)的溫度過高或者過低均不利于果膠酶的產(chǎn)生。當溫度較低時，菌體代謝緩慢，所產(chǎn)的酶量也較少;當溫度較高時，菌體自身代謝所需酶的活性降低，導致發(fā)酵減緩，從而影響產(chǎn)酶。

2.4.5 誘導劑 表面活性劑可以改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)的酶更容易通過細胞膜滲出，細胞內(nèi)的酶逐漸合成，細胞外的酶則持續(xù)集聚，因而增加了酶的產(chǎn)量。由圖11可知，麩皮的誘導效果最佳，其酶活為121.07 U/mL，其他4種誘導劑也有誘導效果，但是沒有麩皮的效果好，因此確定最佳誘導劑為麩皮。

2.4.6 金屬離子 金屬離子是微生物生長和新陳代謝所必需的，同時，一些無機金屬離子也是酶的激活劑，從圖12可以看出，氯化鉻、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋇、氯化鈣、硫酸鎂均能提高果膠酶活性，其中以氯化鉀的促進作用最強，說明鉀離子與酶之間可能存在潛在的結合關系[27]。

從圖13可以看出，氯化鉀的最佳添加量為0.75 g，此時果膠酶活性為122.45 U/mL。隨著氯化鉀含量的增加，出現(xiàn)峰值之后，果膠酶活呈下降趨勢，說明氯化鉀含量在一定范圍內(nèi)對果膠酶活性起到促進作用，含量過高反而會導致果膠酶失活。

2.4.7 初始pH值 從圖14可以看出，當pH值為5時，果膠酶活性達到124.03 U/mL。隨著pH值的升高，出現(xiàn)峰值后，果膠酶活性呈下降趨勢。pH值太低或太高會改變培養(yǎng)基中有機化合物的離子化作用程度，干擾物質(zhì)進出細胞，從而影響產(chǎn)酶效率[28]。因此，確定該菌種最佳生產(chǎn)酶pH值為5，符合真菌來源的果膠酶較細菌偏酸的報道[29]。

2.4.8 接種量 從圖15可以看出，接種量在1%～6%間變動時，果膠酶的活性先上升后下降，當接種量為3%時達到最高。當接種量太小時會使初期菌種生長緩慢，導致延長生產(chǎn)酶周期;當接種量太大時，前期菌體生長繁殖速度快，營養(yǎng)物質(zhì)主要用于細胞的合成，導致酶的合成下降。因此，確定該菌種的最佳接種量為3%。

2.5 利用正交試驗優(yōu)化產(chǎn)酶條件

正交試驗結果見表2。對試驗所得的結果進行統(tǒng)計分析，從直觀分析和極差分析中確定最佳組合。

從表2可以看出，對產(chǎn)酶影響因素的次序從大

到小為B>C>A>D。從表3方差分析可知，初始pH值對產(chǎn)酶量影響極顯著，溫度、接種量對產(chǎn)酶影響顯著，而C/N對產(chǎn)酶影響不顯著，與直觀分析結果一致。因此，最佳方案為 A2B3C1D2，即果膠酶的最佳液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件：發(fā)酵初始pH值為6，溫度為28 ℃，C/N為1 ∶2，接種量為2%，在該條件下果膠酶活性達到126.68 U/mL。

3 結論與討論

本研究以1株分離篩選自海拔2 500～3 000 m鹽井土壤樣品中的真菌為研究對象，結合形態(tài)學、rDNA-ITS序列測序及系統(tǒng)發(fā)育樹、生理生化特性對該菌株進行鑒定，鑒定該菌株為曲霉屬真菌，命名為棘孢曲霉GLUT-01。該菌株能耐受較大范圍的NaCl濃度，且能以多種芳香類化合物為底物生長。此外，它可以產(chǎn)果膠酶，這擴大了產(chǎn)果膠酶菌種來源。

在本研究中，對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，得到該菌種單因素最佳發(fā)酵條件：碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，C/N為1 ∶2，金屬離子為K+且添加量為0.75 g，接種量為3%，誘導劑為麩皮，溫度為30 ℃，培養(yǎng)基初始pH值為5.0。通過4因素3水平的正交試驗確定果膠酶發(fā)酵的最優(yōu)條件：C/N為1 ∶2，培養(yǎng)基初始pH值為6，溫度為28 ℃，接種量為2%。在此最佳條件下發(fā)酵得到的果膠酶活性達到126.68 U/mL。之前也有文獻報道， 產(chǎn)果膠酶微生物有枯草芽孢桿菌等[30-31]，且多為細菌，目前對中度嗜鹽真菌產(chǎn)果膠酶的研究較少，該菌種在偏酸及高鹽環(huán)境下果膠酶活性較高，具有一定的應用價值。

目前，筆者只對菌株棘孢曲霉GLUT-01 進行了初步研究，今后將進一步對其所產(chǎn)果膠酶進行酶學性質(zhì)研究， 并將其應用于高鹽環(huán)境下果膠的處理中，明確其在高鹽環(huán)境下降解果膠的能力。

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