何 平,張 健,池玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

乳白耙齒菌(Irpexlacteus)又名白囊耙齒菌[1]，隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycets)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、耙齒菌屬(Irpex)[2]，它屬于白腐菌的一種，一般生于闊葉樹的枝條上[3]。研究顯示白腐菌可以產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶，漆酶和錳過氧化物酶，其中錳過氧化物酶[Manganese peroxidase (MnP)]，既可以氧化木質(zhì)素中的酚類結(jié)構(gòu)單元又可以氧化非酚類的結(jié)構(gòu)單元，是一種高效的木質(zhì)素降解酶[4]，而霉菌、細(xì)菌和酵母菌等都不產(chǎn)生錳過氧化物酶。據(jù)研究MnP不僅可以降解木材中的木質(zhì)素應(yīng)用于造紙業(yè)，還可以對染料等有毒酚類物質(zhì)進(jìn)行降解脫色并應(yīng)用于工業(yè)廢水治理，因此近些年來MnP被廣泛應(yīng)用及研究。而錳過氧化物酶是一種誘導(dǎo)酶類，其合成水平不僅與菌株本身的產(chǎn)酶能力密切相關(guān)，同時還受不同的培養(yǎng)條件[5-7]、特別是誘導(dǎo)劑的影響。而根據(jù)誘導(dǎo)途徑的不同可將誘導(dǎo)劑分為3類，首先是易被代謝的底物，如果糖，葡萄糖等可以提供生長能源和電子來源的物質(zhì)；其次是與降解底物有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，這些物質(zhì)既是誘導(dǎo)底物，又是降解底物；第三種是酶結(jié)構(gòu)有關(guān)的誘導(dǎo)物，可促進(jìn)酶的產(chǎn)生，如Cu2+、Mn2+、血紅素等。比如添加適量的金屬離子Mn2+對大多數(shù)真菌MnP的產(chǎn)量有很大的誘導(dǎo)作用，因為Mn2+存在于MnP酶蛋白的活性位點上，會影響MnP基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄，所以也是MnP分泌的必要誘導(dǎo)劑。本研究檢測了各種類型誘導(dǎo)劑對乳白耙齒菌的產(chǎn)MnP活性的作用，進(jìn)一步完善了乳白耙齒菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，對完善乳白耙齒菌最優(yōu)培養(yǎng)基，使Irpexlacteus高效產(chǎn)出MnP具有重要意義，為造紙工業(yè)中生物制漿技術(shù)的進(jìn)一步研究應(yīng)用及環(huán)境中有害物質(zhì)的降解等問題的解決提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源、培養(yǎng)基與菌種復(fù)壯

本研究中試驗菌種乳白耙齒菌(Irpexlacteus)由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)科森林病蟲病理實驗室提供，試驗前菌種保存在Potato Dextrose Agar (PDA) 培養(yǎng)基斜面上，冷藏于4 ℃ 冰箱中。

取出保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的乳白耙齒菌(Irpexlacteus)，在室溫下靜置24 h后，轉(zhuǎn)接入新的PDA平板培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)，6 d左右菌絲長滿整個平板。此時菌種的生長勢最旺盛，作為后續(xù)試驗供試菌株。

1.2 初始Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性的測定

將生長在PDA培養(yǎng)基6 d的Irpexlacteus菌株轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)5，7，9，11，13，15，17，20 d時提取酶液，測定MnP活性。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(L-1)：葡萄糖10 g，酒石酸銨6 mmol，MnSO4·H2O 0.030 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO40.2 g，吐溫80 1 mL，礦物元素溶液(L-1):Ferric-citrate·H2O 0.087 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g,MnSO4·H2O 0.45 g,CoCl2·6H2O 0.1 g,CuSO4·5H2O 0.01 g 10 mL，維生素溶液(L-1):D-biotin 0.002 g,Folic acid 0.002 g,Thiamine·HCl 0.005 g,Riboflavin 0.005 g,Pyridoxine·HCl 0.01 g,Cyanocobalamin 0.000 1 g,Nicotinic acid 0.005,Calsium Pantothenate 0.005,P-aminobenzoic acid 0.005,DL-6,8-thioctic acid 0.005)1 mL,pH值為7。

MnP活性測定方法，在37 ℃條件下，測定體系1 mL,其中pH=4.5的丙二酸鈉緩沖液(50 mmol/L) 840 μL，MgSO4溶液(10 mmol/L) 50 μL，2,6-DMP溶液(10 mmol/L) 50 μL，待測酶液50 μL，H2O2溶液(10 mmol/L) 10 μL，以1 mL去離子水作為對照，測定470 nm處吸光度在1 min內(nèi)的變化值。上述條件下，每分鐘催化1 μmol 2,6-DMP所需的酶量。酶活計算公式如下：MnP活力=[106×V1×ΔA×N]/[V2×ε470×Δt]。計算中ε470=49 600[(mol/L)·cm]-1。

1.3 誘導(dǎo)劑對錳過氧化物酶活性的誘導(dǎo)

1.3.1 單獨誘導(dǎo)劑的初篩選試驗 參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]，本研究共選擇12種2大類誘導(dǎo)劑作為Irpexlacteus產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)劑，其中生物誘導(dǎo)劑2種：麥麩和木屑；化學(xué)誘導(dǎo)劑10種：愈創(chuàng)木酚、苯酚、香蘭素、藜蘆醇、苯甲酸、沒食子酸、酪氨酸、二甲苯、苯胺藍(lán)和ABTS。麥麩和木屑的添加量均為1.5%，在初始配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時加入；其他化學(xué)誘導(dǎo)劑配制成高濃度母液過濾除菌，在Irpexlacteus在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第3天時加入，使誘導(dǎo)劑添加的終濃度均為0.5 mmol/L。以不加誘導(dǎo)劑的初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為對照，每組重復(fù)3次，隔天測定MnP活性，獲得各單項誘導(dǎo)劑的MnP活性曲線，進(jìn)而初步篩選出對Irpexlacteus產(chǎn)MnP誘導(dǎo)效果好的生物和化學(xué)誘導(dǎo)劑。

1.3.2 誘導(dǎo)劑濃度單因素試驗 根據(jù)各單項誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)結(jié)果，篩選出誘導(dǎo)Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性較高的誘導(dǎo)劑，進(jìn)行最佳誘導(dǎo)劑的不同濃度單因素試驗，測定MnP活性，以確定該誘導(dǎo)劑的最適添加量。

1.3.3 誘導(dǎo)劑組合及Mn2+濃度對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的影響 測定兩種最佳誘導(dǎo)劑在最適濃度下，同時添加時對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的影響，確定誘導(dǎo)劑組合效果是否優(yōu)于單項誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)MnP的產(chǎn)生。

再添加最佳誘導(dǎo)劑組合的基礎(chǔ)上改變Mn2+濃度，檢測MnP活性，確定Mn2+最適添加量。綜合分析最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始Irpex lacteus產(chǎn)錳過氧化物酶活性的測定

圖1 Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性Fig.1 MnP activity of Irpex lacteus

在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件下，檢測了在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中Irpexlacteus的MnP活性，得到的結(jié)果(圖1)所示可以看出，Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性在第5天到第7天急劇上升，最高峰在第7天時出現(xiàn)此時MnP活性為12.7 U/L，MnP活性由1.81 U/L急劇上升至12.7 U/L上漲約7倍，第7天到第9天MnP活性急劇下降，在第9天到第20天期間MnP活性變化趨于平穩(wěn)在3.7 U/L至5.8 U/L之間浮動。

1：麥麩；2：木屑；3：愈創(chuàng)木酚；4：苯酚；5：香蘭素；6：藜蘆醇；7：苯甲酸；8：沒食子酸；9：酪氨酸；10：二甲苯；11：苯胺藍(lán)；12：ABTS；13：對照組1:wheat bran;2:sawdust;3:guaiacol;4:phenol;5:vanillin;6:veratryl alcohol;7:benzoic acid;8:gallic acid;9:tyrosine;10:xylene;11:aniline blue;12:ABTS;13:control group圖2 17 d時誘導(dǎo)劑對錳過氧化物酶活性的影響Fig.2 Effect of 17-day inducer on manganese peroxidase activity

2.2 誘導(dǎo)劑的篩選試驗

本試驗所選擇的12種誘導(dǎo)劑對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導(dǎo)效果不同，通過隔天測定各MnP活性的方式分析各誘導(dǎo)劑效果，從表1可以確定第17天為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)Irpexlacteus產(chǎn)MnP高峰。12種誘導(dǎo)劑在第17天時對誘導(dǎo)Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導(dǎo)結(jié)果(圖2)可以看出，化學(xué)誘導(dǎo)劑中ABTS的誘導(dǎo)效果最好，此時MnP的酶活為145.161 U/L，是在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中對照培養(yǎng)酶活(13.306 U/L)的11倍；其次為沒食子酸，是對照酶活的5.6倍。其他誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果一般。對于2種生物誘導(dǎo)劑麥麩和木屑來說，產(chǎn)酶高峰為13 d，在13 d時酶活分別為104.234 U/L、48.992 U/L，分別是對照酶活的8.6倍、4.1倍，可見麥麩的誘導(dǎo)效果優(yōu)于木屑。根據(jù)以上結(jié)果選擇出對乳白耙齒菌錳過氧化物酶活性的誘導(dǎo)較好的誘導(dǎo)劑為麥麩、ABTS和沒食子酸。

2.3 誘導(dǎo)劑濃度單因素試驗

通過單項誘導(dǎo)劑的篩選，選擇了誘導(dǎo)效果最好的生物誘導(dǎo)劑麥麩和化學(xué)誘導(dǎo)劑的ABTS，進(jìn)行最佳誘導(dǎo)劑不同濃度的單因素試驗，以確定該誘導(dǎo)劑的最適添加量。麥麩添加量設(shè)置3個濃度梯度，分別為1%、1.5%和2%，化學(xué)誘導(dǎo)劑ABTS的添加量設(shè)置了共6個濃度梯度，分別為0.05，0.2，0.5，1，1.5，2 mmol/L，以不加誘導(dǎo)劑的初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為對照，每組重復(fù)3次，隔天測定錳MnP活性，分別得到了不同濃度的麥麩和ABTS對Irpexlacteus產(chǎn)MnP活性的誘導(dǎo)結(jié)果。從表2看出除濃度為1.5 mmol/L和2.0 mmol/L麥麩培養(yǎng)的產(chǎn)酶高峰為第13天和第15天外，其他濃度的ABTS在第19天時對MnP的誘導(dǎo)效果都達(dá)到最好，而且MnP活性平均值均高過濃度為1.5 mmol/L和2.0 mmol/L時。麥麩培養(yǎng)的產(chǎn)酶高峰均出現(xiàn)在第13天，圖3顯示了不同濃度的ABTS在第19天時對錳過氧化物酶的誘導(dǎo)結(jié)果，圖4顯示了不同濃度的麥麩在第13天時對錳過氧化物酶的誘導(dǎo)結(jié)果。

表1 12種誘導(dǎo)劑對錳過氧化物酶活性的影響

表2 麥麩和ABTS濃度對錳過氧化物酶活性的影響

由圖3可知，不加ABTS，MnP的活性很低；加入少量的ABTS(0.05 mmol/L)，MnP的活性顯著提高，也表明了ABTS對MnP的顯著誘導(dǎo)能力，當(dāng)ABTS濃度為0.2 mmol/L時誘導(dǎo)的MnP活性達(dá)到最高，酶活為193.347 U/L，是對照酶活的14.5倍，高過了1.5%的麥麩對MnP的誘導(dǎo)效果，但ABTS濃度增加到0.5 mmol/L時，MnP的活性就開始下降了，說明過高濃度的ABTS不利于菌體產(chǎn)生MnP，同時也說明過高濃度ABTS對菌絲體也有毒害作用。由圖4可以看出，不加麥麩，MnP的活性很低；加入1%的麥麩，MnP的活性顯著提高，表明麥麩對MnP有顯著誘導(dǎo)能力，麥麩含量為1.5%培養(yǎng)時間為13 d時，MnP的酶活性最高，為99.395 U/L；但麥麩含量升高到2%時，MnP的活性又下降，可能是麥麩含量過高影響了培養(yǎng)基中的含氧量，導(dǎo)致菌體生長欠佳，不利于MnP的合成。

圖3 ABTS濃度對錳過氧化物酶活性的影響Fig.3 Effect of ABTS concentration on manganese peroxidase activity

圖4 麥麩含量對錳過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect of wheat bran content on manganese peroxidase activity

2.4 Mn2+濃度及誘導(dǎo)劑組合對Irpex lacteus產(chǎn)MnP活性的影響

在不加Mn2+和添加0.2 mmol/L Mn2+的情況下，分別檢測了麥麩和ABTS 2種最佳誘導(dǎo)劑在最適濃度下單獨添加和同時添加時Irpexlacteus的MnP活性，發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)劑組合的情況下，Irpexlacteus的產(chǎn)酶高峰變?yōu)榈?7天，在第17天的酶活結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出：無論是否添加Mn2+，同時添加麥麩和ABTS 2種誘導(dǎo)劑，比單獨添加其中1種誘導(dǎo)劑的MnP活性高，即麥麩和ABTS這2種誘導(dǎo)劑組合的誘導(dǎo)效果優(yōu)于任何1個單項誘導(dǎo)劑；在含有0.2 mmol/L Mn2+的情況下，無論是單項誘導(dǎo)劑還是2種誘導(dǎo)劑組合，都比不添加Mn2+的誘導(dǎo)效果更好，最高的錳過氧化物酶活性出現(xiàn)在含有0.2 mmol/L Mn2+，同時添加1.5%麥麩和0.2 mmol/L ABTS時，此時錳過氧化物酶活性為203.226 U/L，是對照酶活的21.9倍。因此確定同時添加Mn2+和1.5%麥麩和0.2 mmol/L ABTS為最佳誘導(dǎo)劑組合。

圖6顯示了在培養(yǎng)液內(nèi)添加最佳誘導(dǎo)劑組合的同時，添加不同濃度Mn2+的MnP活性在17 d時的變化情況。Mn2+的濃度設(shè)置了6個濃度梯度，分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，3.0 mmol/L。結(jié)果表明Mn2+的濃度不同，錳過氧化物酶的活性也不同，基本上是低濃度促進(jìn)，較高濃度對產(chǎn)酶也有促進(jìn)作用，但效率降低。當(dāng)Mn2+濃度在0～0.2 mmol/L期間時錳過氧化物酶活性隨Mn2+濃度增加而增加，在0.2 mmol/L時活性達(dá)到最高，Mn2+濃度超過0.2 mmol/L后活性隨Mn2+濃度增加而逐漸下降，但比不加Mn2+的對照組時酶活性高，分析原因是Mn2+為重金屬離子，過高M(jìn)n2+濃度對菌體有毒性，對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，同時也抑制了菌體對錳過氧化物酶的分泌。

圖5 2種誘導(dǎo)劑組合對MnP活性的影響Fig.5 Effect of two inducers on MnP activity

圖6 Mn2+濃度對MnP活性的影響Fig.6 Effect of Mn2 + concentration on MnP activity

3 結(jié)論與討論

在乳白耙齒菌產(chǎn)MnP的過程中，加入一些與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的化合物做為誘導(dǎo)劑，如酚類或者芳香族化合物能大大提高M(jìn)nP的產(chǎn)量，誘導(dǎo)劑的種類和添加量對MnP活性都有顯著影響[11]。因此，誘導(dǎo)劑及用量的選擇是MnP優(yōu)化工藝中非常關(guān)鍵的步驟而不可或缺。本實驗共選擇12種底物作為白腐菌乳白耙齒菌(Irpexlacteus)產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)劑，進(jìn)行了單項誘導(dǎo)劑的篩選試驗、最佳單項誘導(dǎo)劑濃度的單因素試驗，2種最佳誘導(dǎo)劑組合、Mn2+濃度對MnP活性的影響試驗等，通過逐級篩選結(jié)果表明：在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入0.2 mmol/L Mn2+的情況下，生物誘導(dǎo)劑麥麩和化學(xué)誘導(dǎo)劑ABTS誘導(dǎo)的Irpexlacteus產(chǎn)MnP酶活高、效果好，在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)Irpexlacteus分別加入1.5%的麥麩和0.2 mmol/L的ABTS，在產(chǎn)酶高峰時MnP酶活分別是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)Irpexlacteus酶活的8.6倍和11倍；而這兩種最佳誘導(dǎo)劑在最適濃度下組合的誘導(dǎo)效果又優(yōu)于使用任何一種單項誘導(dǎo)劑，即同時添加1.5%麥麩與0.2 mmol/L ABTS誘導(dǎo)劑效果更好，在28 ℃靜置培養(yǎng)的條件下，酶活峰值可達(dá)203.226 U/L，是初始培養(yǎng)條件錳過氧化物酶活性的21.9倍，表明誘導(dǎo)劑能大幅度地提高Irpexlacteus的錳過氧化物酶活性。因此，得出乳白耙齒菌Irpexlacteus產(chǎn)錳過氧化物酶的最適條件：在100 mL三角瓶中加入初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基30 mL，其中添加1.5%麥麩，接入3塊直徑9 mm的菌餅，在28 ℃下靜置培養(yǎng)培養(yǎng)3 d后，再添加0.2 mmol/L的Mn2+和0.2 mmol/L的ABTS，繼續(xù)在28 ℃下靜置培養(yǎng)17 d達(dá)到其產(chǎn)酶高峰。此時錳過氧化物酶活性為203.226 U/L，是對照酶活的21.9倍。王忠艷等[15]對乳白耙齒菌最佳培養(yǎng)及配方進(jìn)行了優(yōu)化研究，楊曉寬等[16]對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶培養(yǎng)基的優(yōu)化做了研究，本文在該研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行誘導(dǎo)劑實驗，使MnP的活性得到了提高，表明乳白耙齒菌(Irpexlacteus)所產(chǎn)得MnP是一種誘導(dǎo)型酶，其合成不僅易受培養(yǎng)條件的影響，更受到誘導(dǎo)劑的影響，適宜的誘導(dǎo)劑能大幅度地提高乳白耙齒菌(Irpexlacteus)的MnP活性。