熊賢榮，歐陽(yáng)嘉暉，龍海燕，熊 丹，歐 靜

(貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

桃葉杜鵑(RhododendronannaeFranch.)是杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，為高山常綠杜鵑代表種[1]，其花艷麗奪目，葉形美觀，樹(shù)冠圓滿(mǎn)，花期5—6月，是一種觀賞價(jià)值高、開(kāi)發(fā)潛力大的園林樹(shù)種，但其喜涼爽濕潤(rùn)氣候，且根系為淺根系，不能伸入土層深處，不耐干旱，嚴(yán)重制約其引種栽培及園林應(yīng)用。菌根(Mycorrhiza)是一類(lèi)土壤真菌與高等植物根系形成的共生體系，其在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[2]，能夠促進(jìn)根系對(duì)水分的吸收，防止根系內(nèi)水分的喪失，改善寄主植物的水分狀況，提高植物的抗旱性[3]。

干旱影響植物生產(chǎn)發(fā)育的主要非生物脅迫之一，其對(duì)植物生長(zhǎng)的影響直接體現(xiàn)在植物葉片失水，細(xì)胞膜遭到破壞，嚴(yán)重時(shí)破壞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，加速其衰老進(jìn)程，最終導(dǎo)致植物死亡[4]。目前對(duì)于干旱脅迫下接種菌根對(duì)植物根系的研究主要集中在植物根系形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)方面，如王如巖等[3]發(fā)現(xiàn)接種內(nèi)生菌根能促進(jìn)楸樹(shù)根系形態(tài)發(fā)展，在正常水分和中度干旱條件下內(nèi)生菌根真菌對(duì)楸樹(shù)生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。張亞敏等[5]通過(guò)對(duì)小馬鞍羊蹄甲幼苗接種AMF，發(fā)現(xiàn)AMF能顯著影響幼苗根系形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)特征,更利于植物適應(yīng)干旱環(huán)境。在自然環(huán)境條件下，杜鵑屬植物根系能與一些土壤真菌形成典型特征的共生體，稱(chēng)為杜鵑花類(lèi)菌根或歐石南類(lèi)菌根(Ericoidmycorrhizal，ERM)[6]，在杜鵑花類(lèi)植物的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要角色，它能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)植物克服惡劣環(huán)境、加強(qiáng)吸收養(yǎng)分起到很重要的作用[7-8]，能增強(qiáng)宿主植物的競(jìng)爭(zhēng)力和抗逆性[9]，有研究證明ERM可以增強(qiáng)宿主抗旱性[10]。在超微結(jié)構(gòu)方面,菌根的形成對(duì)寄主質(zhì)膜及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有一定的影響，而且菌根的形成會(huì)影響寄主質(zhì)膜及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)從而影響細(xì)胞內(nèi)的液泡、線(xiàn)粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器[11-12]。而關(guān)于干旱脅迫下菌根對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道， 桃葉杜鵑的根系由大量細(xì)弱如發(fā)的須根組成，由1層表皮細(xì)胞、1～2層皮層細(xì)胞和中柱組成，本實(shí)驗(yàn)材料為1年生桃葉杜鵑幼苗，進(jìn)行干旱脅迫處理，通過(guò)觀察根系中柱細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，分析接種ERM真菌對(duì)桃葉杜鵑幼苗抗旱性影響，從而闡明接種菌根對(duì)植株抗旱性的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在貴州大學(xué)南校區(qū)林學(xué)院苗圃進(jìn)行，屬于亞熱帶濕潤(rùn)溫和型氣候，年平均氣溫在15.3 ℃左右，海拔1 100 m。

1.2 供試菌株

供試的2個(gè)試驗(yàn)菌株為前期從野生桃葉杜鵑根系分離并篩選出的綜合促生能力和侵染率較強(qiáng)的菌株[13-14]:TY29(AB158314：Trametesochracea)，TY35(AB378554：Pochonia bulbill-osa)(括號(hào)中前者為國(guó)際GenBank中的登錄號(hào)，后者為與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近種),由課題組分離保存。采用PDA液體培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，置于28 ℃搖床上振蕩(160 r/min)暗培養(yǎng)15 d，打碎并制成液體菌劑備用。

1.3 試驗(yàn)苗木

試驗(yàn)苗為通過(guò)播種繁殖培養(yǎng)的1年生桃葉杜鵑幼苗，采用播種繁殖，播種方法采用撒播，100粒每盆，于2015年12月播種后放入人工氣候箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)(白天、夜間都為25 ℃，濕度為90%、光照12 h)，2016年6月12日移栽到花盆中，每盆移植1株桃葉杜鵑幼苗，移栽成活后于每株苗根部各施入菌液5 mL，CK苗則做不澆菌液處理。同一個(gè)處理隨機(jī)擺放，各處理之間相互隔離，進(jìn)行常規(guī)育苗方法管理。栽植花盆規(guī)格為90 cm×60 cm×80 cm(口徑×地徑×高)，土壤基質(zhì)為腐殖土和石英砂按3∶1比例混合。

1.4 干旱脅迫處理

2016年8月選取生長(zhǎng)一致的植株進(jìn)行脅迫處理，每個(gè)處理15盆，每盆1株，各處理重復(fù)3次。用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素A為接菌處理，設(shè)3個(gè)處理，分別是：TY29、TY35和對(duì)照CK；因素B為干旱脅迫處理，設(shè)4個(gè)脅迫梯度，按正常澆水(土壤含水率80%～90%，作為干旱脅迫的對(duì)照) 、輕度干旱(土壤含水率65%～75%) 、中度干旱(土壤含水率50%～60%)和重度干旱(土壤含水率35%～45%)進(jìn)行處理。每天下午通過(guò)稱(chēng)重法維持土壤相對(duì)含水量保持在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，其他管理一致，每天傍晚補(bǔ)足白天損失的水分，連續(xù)處理30 d后測(cè)定各指標(biāo)。

1.5 樣品的制備觀察與測(cè)定

(1)取材與固定：水分脅迫30 d后，取幼苗相同部位須根根尖2 mm左右的小段，將樣品放入濃度為2.5%的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h以上。

(2)制片與觀察：將樣品取出，用pH為7.2的磷酸緩沖溶液漂洗3次，每次25 min，再經(jīng)過(guò)30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，每級(jí)停留30 min，然后用環(huán)氧丙烷置換過(guò)渡，Epon812滲透包埋，經(jīng)超薄切片機(jī)切片后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對(duì)染，最后置于Hu212A透射電鏡下觀測(cè)須根根尖中柱細(xì)胞并拍照(桃葉杜鵑細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)制片與拍照均在上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行)。

(3)指標(biāo)測(cè)定：2016年8月對(duì)菌根侵率進(jìn)行測(cè)定，植株收獲時(shí)菌根侵染率按Phillips[15]方法測(cè)定,涉及到的計(jì)算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數(shù)/檢測(cè)的根段總數(shù))×100%

(1)

菌根依賴(lài)性=(接種植株平均干質(zhì)量/對(duì)照植株平均干質(zhì)量) ×100%

(2)

菌根貢獻(xiàn)率=(接種植株平均干質(zhì)量-不接種植株平均干質(zhì)量)/接種植株平均干質(zhì)量×100%

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根侵染率

兩種ERM菌株的侵染率存在差異，其中TY35的侵染率比TY29的侵染率要高，未接種的CK處理幼苗根系侵染率為0，極顯著低于接種處理幼苗根系的侵染率。不同菌株對(duì)宿主植物根系表現(xiàn)出的親和力具有差異性，即反映出了宿主植物對(duì)不同菌根真菌的依賴(lài)性不同。接種苗的菌根依賴(lài)性均大于100%，TY35達(dá)到147.89%，菌根貢獻(xiàn)率為32.38%。TY29菌根依賴(lài)性達(dá)到118.23%，菌根貢獻(xiàn)率為13.65%。

2.2 正常水分條件下的根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

正常水分條件下，桃葉杜鵑各處理幼苗的須根中柱細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同，細(xì)胞完整，膜清晰，緊貼細(xì)胞壁，細(xì)胞呈梯形或近長(zhǎng)方形，細(xì)胞器豐富，各細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)均呈正常狀態(tài)，位于細(xì)胞邊緣，液泡較大，位于細(xì)胞中央(圖1 a1、b1、c1)。桃葉杜鵑的線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形，雙層膜清晰可見(jiàn)，內(nèi)嵴豐富，著色較深。此外，正常的細(xì)胞內(nèi)還分布著由數(shù)個(gè)扁平囊泡垛疊而成的高爾基體(圖1 a2、b2、c2)。

a1，a2為CK根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；b1，b2為T(mén)Y29根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；c1，c2為T(mén)Y35根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；CW：細(xì)胞壁；M：線(xiàn)粒體；G：高爾基體；放大倍數(shù)：a1×6 000;a2×20 000;b1×5 000;b2×20 000;c1×5 000;c2×20 000a1，a2:CK root cells and mitochondrial;b1，b2:TY29 root cells and mitochondrial;c1，c2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondria;G:golgi;Magnification:a1×6 000;a2×20 000;b1×5 000;b2×20 000;c1×5 000;c2×20 000圖1 正常水分條件下桃葉杜鵑幼苗根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under normal water conditions

2.3 輕度脅迫條件下的根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

輕度脅迫下，CK的須根中柱結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到一定的破壞，液泡內(nèi)陷成許多小泡散布在細(xì)胞內(nèi)部，多數(shù)細(xì)胞器開(kāi)始向細(xì)胞中央聚攏(圖2 d1)。線(xiàn)粒體增多，且體積變得膨脹，外膜結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)部嵴開(kāi)始出現(xiàn)斷裂，片層結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞中未見(jiàn)高爾基體的分布(圖2 d2)。TY29局部細(xì)胞膜破裂，中央液泡也開(kāi)始破裂，細(xì)胞內(nèi)容物都在降解，但程度較輕，各細(xì)胞器沒(méi)有貼壁分布(圖2 e1)。線(xiàn)粒體外膜結(jié)構(gòu)變得模糊，內(nèi)部嵴減少，出現(xiàn)較多的嗜鋨顆粒(圖2 e2)。TY35的細(xì)胞未出現(xiàn)變形，細(xì)胞膜局部破損，但內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)基本正常(圖2 f1)。線(xiàn)粒體增多，雙膜結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)部嵴豐富，形態(tài)正常，高爾基體結(jié)構(gòu)變得模糊，細(xì)胞內(nèi)還出現(xiàn)了較多的淀粉粒(圖2 f2)。

d1，d2：CK根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；e1，e2：TY29根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；f1，f2：TY35根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；CW：細(xì)胞壁；M：線(xiàn)粒體；Sg：淀粉粒；OG：嗜鋨顆粒；放大倍數(shù)：d1×10 000;d2×20 000;e1×5 000;e2×10 000;f1×8 000;f2×20 000d1，d2:CK root cells and mitochondrial;e1，e2:TY29 root cells and mitochondrial;f1，f2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondria;Sg:starch granules;OG:Osmium granule;Magnification:d1×10 000;d2×20 000;e1×5 000;e2×10 000;f1×8 000;f2×20 000圖2 輕度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under mild stress

g1，g2：CK根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；h1，h2：TY29根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；i1，i2：TY35根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；CW：細(xì)胞壁；M：線(xiàn)粒體；N：細(xì)胞核；放大倍數(shù)：g1×10 000;g2×20 000;h1×10 000;h2×20 000;i1×6 000;i2×20 000g1，g2:CK root cells and mitochondrial;h1，h2:TY29 root cells and mitochondrial;i1，i2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondrial;N:nuclear;Magnification:g1×10 000;g2×20 000;h1×10 000;h2×20 000;i1×6 000;i2×20 000圖3 中度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under moderate stress

2.4 中度脅迫條件下的根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

隨著脅迫加劇，各處理苗的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化愈加明顯，受傷害程度進(jìn)一步加深。CK根細(xì)胞形態(tài)因失水變得收縮扭曲，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，內(nèi)含物流出，細(xì)胞核嚴(yán)重變形，核膜降解，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核降解為小碎片散布在細(xì)胞內(nèi)部(圖3 g1)。線(xiàn)粒體體積進(jìn)一步膨大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)降解(圖3 g2)。TY29的根細(xì)胞變化程度小于CK，細(xì)胞輕微變形，膜破損，細(xì)胞內(nèi)部基質(zhì)凝聚成深色物質(zhì)，細(xì)胞核外膜存在，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)始降解，與線(xiàn)粒體仍能較好的區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖3 h1)。線(xiàn)粒體外膜消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊(圖3 h2)。TY35細(xì)胞膜開(kāi)始降解，根細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到的傷害最小，細(xì)胞內(nèi)部各細(xì)胞器能明顯區(qū)分，仍可見(jiàn)液泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核核膜完好，細(xì)胞核內(nèi)部染色質(zhì)開(kāi)始凝聚，核仁開(kāi)始降解(圖3 i1)。線(xiàn)粒體的外膜結(jié)構(gòu)完好，內(nèi)部嵴出現(xiàn)斷裂，片層結(jié)構(gòu)紊亂(圖3 i2)。

2.5 重度脅迫條件下的根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

重度脅迫下，干旱處理對(duì)各幼苗根細(xì)胞的傷害進(jìn)一步加深。CK的根細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全被破壞，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器解體，細(xì)胞空泡化，僅留下一些細(xì)胞器的殘骸(圖4 j1、j2)。TY29的細(xì)胞壁出現(xiàn)斷裂，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器也大量降解，僅存少部分殘存的線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也已經(jīng)降解，內(nèi)腔出現(xiàn)空洞(圖4 k1、k2)。TY35的根細(xì)胞整體形態(tài)較完整，細(xì)胞內(nèi)部基質(zhì)凝聚成深色物質(zhì)，細(xì)胞核外膜存在，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)凝聚(圖4 l1)。線(xiàn)粒體外膜仍較完整，嵴斷裂嚴(yán)重，內(nèi)部結(jié)構(gòu)開(kāi)始降解(圖4 l2)。

j1，j2：CK根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；k1，k2：TY29根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；l1，l2：TY35根細(xì)胞與線(xiàn)粒體；CW：細(xì)胞壁；M：線(xiàn)粒體；N：細(xì)胞核；放大倍數(shù)：j1×10 000;j2×20 000;k1×5 000;k2×20 000;l1×10 000;l2×20 000 j1，j2:CK root cells and mitochondrial;k1，k2:TY29 root cells and mitochondrial;l1，l2:TY35 root cells and mitochondrial;CW:cell wall;M:mitochondrial;N:nuclear;Magnification:j1×10 000;j2×20 000;k1×5 000;k2×20 000;l1×10 000;l2×20 000圖4 重度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of root cells of Rhododendron annae seedlings under serious stress

3 討論

菌根真菌能夠提高植物的抗旱性，因?yàn)榫婢谕寥乐芯哂旋嫶蟮木z網(wǎng)，可增大植物的吸收面積，降低土壤與植物之間的液流阻力，促進(jìn)根系對(duì)水分的吸收，并且菌套還能防止根系內(nèi)水分的喪失，改善寄主植物的水分狀況，能夠或減緩植物體內(nèi)水分缺失的加劇[3]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從細(xì)胞層次驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，即接種菌根真菌在各種水分處理下，菌根真菌的形成一定程度上減緩植物體內(nèi)水分的缺失，使植株受旱害程度減輕，從而保護(hù)了植物細(xì)胞的完整性。研究還發(fā)現(xiàn)，接種不同的菌株對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)也不同，原因可能是不同菌株對(duì)寄主植物的侵染程度有所不同，或者菌株之間的功能也存在差異。

在相同水分脅迫處理下，桃葉杜鵑根系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，但隨著水分脅迫程度的加強(qiáng)，桃葉杜鵑幼苗表現(xiàn)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化過(guò)程基本一致，由開(kāi)始的根系細(xì)胞細(xì)胞膜破損,液泡膜破裂,類(lèi)囊體腫脹，線(xiàn)粒體腫脹，基質(zhì)變稀,脊減少，最終線(xiàn)粒體解體，其他細(xì)胞器消失，細(xì)胞空泡化。

在干旱脅迫條件下，比較觀察3種處理下桃葉杜鵑的線(xiàn)粒體、細(xì)胞膜、細(xì)胞核等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，是判斷其耐旱能力的方法之一。線(xiàn)粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、數(shù)目和分布常因植物所處的環(huán)境條件不同而發(fā)生相應(yīng)變化，尤其在逆境脅迫下其結(jié)構(gòu)和生理功能的變化更為顯著[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，在輕度干旱脅迫下，3種處理植物根系細(xì)胞均開(kāi)始受損，其中線(xiàn)粒體的損害程度：CK>TY35>TY29,細(xì)胞膜損壞程度：CK>TY29>TY35。此外水分脅迫下,淀粉粒很少見(jiàn)到，其原因是由于水分脅迫引起類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)異常光合作用下降而導(dǎo)致光合產(chǎn)物減少，抑或因其被降解所致[17]，但TY35在輕度干旱脅迫下還能產(chǎn)生較多的淀粉粒,這樣既緩解了能量的短缺，保證細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。在中度干旱脅迫下，細(xì)胞受損程度進(jìn)一步加深，CK苗外膜結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞膜受損程度：TY29>TY35，細(xì)胞核受損程度：CK>TY29>TY35，線(xiàn)粒體的損害程度：CK>TY35>TY29，同時(shí)3種處理都出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)凝聚，其中CK苗內(nèi)含物流出，細(xì)胞受到極大損害。在重度干旱脅迫下，CK苗細(xì)胞整個(gè)空泡化，TY29細(xì)胞出現(xiàn)小空洞，而TY35細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍完整。

4 結(jié) 論

水分脅迫顯著影響桃葉杜鵑幼苗的根系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，接種ERM真菌能在輕度、中度水分脅迫下提高桃葉杜鵑幼苗根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，維持細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的完整，緩解干旱脅迫對(duì)各細(xì)胞器的傷害效應(yīng)。干旱脅迫下桃葉杜鵑幼苗細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的傷害表現(xiàn)與抗旱性相關(guān)。接種TY29與TY35的幼苗的根系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的受損程度在輕度、中度水分脅迫下均小于菌根苗，但重度脅迫下各處理幼苗細(xì)胞結(jié)構(gòu)都受到嚴(yán)重破壞，根據(jù)各處理苗細(xì)胞器的受損情況來(lái)評(píng)價(jià)各處理苗的耐旱能力，即菌根苗的抗旱性較強(qiáng)。