班甜甜，張素勤，肖體菊，徐彥軍，耿廣東*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，貴州貴陽550006；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽550025)

旱害是植物生長過程中常見的危害，它對植物的影響很廣泛，可以從種子的萌發(fā)期延伸到結(jié)果期[1]。干旱首先會使植株葉子出現(xiàn)萎蔫、凋落、黃化等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象能直接反應(yīng)出植物受害程度的大小。根作為植物從外界吸收水分最主要的途徑，干旱對其的危害很大[2]，如阻礙毛細根的伸長和新生根的形成，降低根系活力，導(dǎo)致植物不能正常生長，甚至停止生長[3]。大量研究表明：水分缺失會導(dǎo)致葉綠素的合成受阻，含量降低[4-5]，使葉片上的氣孔關(guān)閉，阻礙植物對CO2的吸收[6]，影響光合效率[7-8]。除此之外在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白的含量都會有一定程度的積累以維持細胞的滲透壓，幫助植株適應(yīng)環(huán)境。植物的抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)保護系統(tǒng)具有清除逆境中產(chǎn)生的O2-、H2O2、OH-等活性氧的功能[9]，減輕對細胞膜透性的傷害。MDA作為膜質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，對細胞有很大的毒性，MDA積累量常作為衡量植物受害程度的重要指標(biāo)[10]。除了外部形態(tài)的變化，SOD、POD、CAT活性和MDA積累量可以作為評價植物抗性的常用指標(biāo)[10]。

草石蠶(StachyssieboldiiMiq.)是水蘇屬多年生草本植物，食用部分為地下莖，營養(yǎng)價值豐富，具有補血、強身、清熱解毒、治咳嗽等功效[11]。草石蠶有一定的耐旱能力，但在極端條件下，其產(chǎn)量和品質(zhì)均會受到很大影響，因此探索草石蠶的抗旱機理，對提高其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。目前，對植物干旱脅迫條件下的生理生化變化的研究較多，但對草石蠶干旱脅迫方面的相關(guān)研究鮮見報道。因此本文以3個抗旱性不同的草石蠶品種為試材，研究干旱脅迫對其保護酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。本研究擬從生理指標(biāo)的變化來探討干旱脅迫對草石蠶的影響，以期了解草石蠶的抗旱機制，并為草石蠶生產(chǎn)中的抗旱問題提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

通過前期干旱處理的預(yù)試驗，由草石蠶的外部形態(tài)所受到的影響發(fā)現(xiàn)“貴栽1號”、“魯引1號”和“贛引1號”3個草石蠶品種對干旱的適應(yīng)能力不同，具體的抗旱能力為：“貴栽1號”(抗旱性強，貴州務(wù)川主栽品種)、“魯引1號”(抗旱性中等，山東濱洲主栽品種)和“贛引1號”(抗旱性弱，江西萍鄉(xiāng)主栽品種)，本實驗以3個抗旱性不同的草石蠶品種為實驗材料，研究干旱對草石蠶相關(guān)生理方面的影響。

1.2 方法

試驗于2016年3月在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)實驗基地大棚內(nèi)進行，常規(guī)育苗，待幼苗長到5葉1心時，將其移栽到盆中(盆中加等量的土)，每盆移栽4棵，每個處理10盆，生長15 d后，進行干旱處理(先澆透水，然后自然干旱)，干旱處理4、8、12和16 d后對其進行各種生理指標(biāo)測定。以正常澆水生長的草石蠶為對照，3次重復(fù)。采樣時間均為08:00—09:00，試驗測定的生理指標(biāo)有可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸(Pro)、SOD、POD、CAT和丙二醛(MDA)，試驗取樣材料為從上到下第3和第4片葉。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白采用考馬斯亮蘭 G-250 染色法，脯氨酸測定采用茚三酮比色法，MDA采用硫代巴比妥酸法[12]；抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的測定采用王學(xué)奎方法測定[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和DPS(V12.01)軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對草石蠶可溶性糖含量的影響

在干旱條件下，3個品種的草石蠶隨脅迫時間延長，可溶性糖含量呈一直上升的變化趨勢(圖1)。處理第8天時，“魯引1號”和“贛引1號”可溶性糖含量明顯上升，而“貴栽1號”可溶性糖含量上升幅度小，僅比對照提高了5.32%，但與對照達到極顯著差異水平；處理第16天時，“魯引1號”、“贛引1號”和“貴栽1號”可溶性糖含量達到最大值，分別比對照提高了134.07%、80.85%和48.28%，且均極顯著高于對照，其中抗旱性強的“貴栽1號”變化幅度最小，抗旱性中等的“魯引1號”變化幅度最大。

圖1 干旱脅迫對草石蠶可溶性糖含量的影響Fig.1 Effect of drought stress on soluble sugar content of Stachys sieboldii Miq.

2.2 干旱脅迫對草石蠶可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，隨脅迫時間延長，“魯引1號”和“贛引1號”可溶性蛋白含量呈先升高后降低的變化趨勢，而“貴栽1號”則一直升高。干旱處理第4天時，3個品種可溶性蛋白含量變化不明顯，與對照未達到顯著差異水平；干旱處理第8天時，“魯引1號”和“贛引1號”比對照有明顯的上升，且在第12天時達到峰值，分別比對照上升了78.15%和57.83%，極顯著高于對照；處理第16天時較最大值有一定的下降，但仍高于對照?？购敌詮姷摹百F栽1號”一直升高，第16天時達到最大值，比對照提高了21.23%，差異達極顯著性水平。

圖2 干旱脅迫對草石蠶可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of drought stress on soluble protein content of Stachys sieboldii Miq.

2.3 干旱脅迫對草石蠶Pro含量的影響

隨干旱脅迫時間延長，3個品種的草石蠶Pro含量呈一直增加的變化趨勢(圖3)。干旱脅迫第4天時，3個品種的Pro含量升高，且與對照達到極顯著性差異水平；干旱脅迫第12天時， Pro含量進一步升高；干旱脅迫第16天時，3個品種的草石蠶Pro含量均達到最大值，與對照相比，“魯引1號”、“贛引1號”和“貴栽1號”分別增加了164.90%、 203.29%和90.08%。由此可知，草石蠶可通過增加Pro含量來適應(yīng)旱害，其中抗旱性強的“貴栽1號”Pro含量增加幅度最小，抗旱性弱的“贛引1號”的Pro含量增加幅度最大。

圖3 干旱脅迫對草石蠶Pro含量的影響Fig.3 Effect of drought stress on Pro content of Stachys sieboldii Miq.

2.4 干旱脅迫對草石蠶SOD活性的影響

隨干旱脅迫時間的延長，3種草石蠶SOD活性均呈一直升高的變化趨勢(圖4)。干旱脅迫第4天時，SOD的活性變化不明顯；干旱脅迫第8天時，3種草石蠶SOD活性均明顯升高，“魯引1號”、“贛引1號”和“貴栽1號”均比對照升高了12.27%、13.63%和13.91%，并均達到極顯著性差異水平；干旱脅迫第16 d時，3種草石蠶SOD活性均升高到最大值，與對照相比，“魯引1號”、“贛引1號” 和“貴栽1號”分別升高了41.67%、35.43%和52.58%，均與第12天處理的達到極顯著差異水平。由此可見，抗旱性強的“貴栽1號”升高幅度最大，抗旱性差的“贛引1號”升高幅度最小。

圖4 干旱脅迫對草石蠶SOD活性的影響Fig.4 Effect of drought stress on SOD activity of Stachys sieboldii Miq.

2.5 干旱脅迫對草石蠶POD活性的影響

隨干旱脅迫時間延長，3種草石蠶的POD活性均呈一直上升的變化趨勢(圖5)。干旱脅迫第4天時，3種草石蠶POD活性與對照相比升高幅度不明顯；干旱脅迫第8天時，3種草石蠶POD活性均有明顯的升高，與對照相比均達到極顯著差異水平；干旱脅迫第12天時，3種草石蠶POD活性進一步升高，與對照相比，“魯引1號”、“贛引1號”和“貴栽1號”分別升高了52.21%、82.05%和50.79%；干旱脅迫第16天時，3種草石蠶POD活性均達到最大值，“貴栽1號”的POD活性最高，“魯引1號”次之，“贛引1號”升高幅度最小。由此可見，抗旱性強的“貴栽1號”POD活性升高幅度最大，抗旱性差的“贛引1號”升高幅度最小。

2.6 干旱脅迫對草石蠶CAT活性的影響

隨干旱脅迫時間延長，3種草石蠶的CAT活性均呈一直上升的變化趨勢(圖6)。干旱脅迫第4天時，3種草石蠶CAT活性與對照相比變化不明顯；干旱脅迫第8天時，3種草石蠶CAT活性與對照的變化明顯，“貴栽1號”升高了91.90%，“贛引1號”升高了27.89%，“魯引1號”升高了40.00%，且均達到極顯著差異水平；干旱脅迫第16天時，3種草石蠶CAT活性均升到最大值，“魯引1號”、“贛引1號”和“貴栽1號”分別比對照升高了124.95%、81.37%和205.81%。由此可見，抗旱性強的“貴栽1號”SOD活性升高幅度最大，抗旱性弱的“贛引1號”升高幅度最小。

圖5 干旱脅迫對草石蠶POD活性的影響Fig.5 Effect of drought stress on POD activity of Stachys sieboldii Miq.

圖6 干旱脅迫對草石蠶CAT活性的影響Fig.6 Effect of drought stress on CAT activity of Stachys sieboldii Miq.

2.7 干旱脅迫對草石蠶MDA積累量的影響

3種草石蠶MDA積累量隨干旱脅迫時間的延長呈一直遞增的變化趨勢(圖7)。干旱脅迫第4天時，3種草石蠶MDA積累量與對照相比變化不明顯；干旱脅迫第8天時，3種草石蠶MDA積累量較對照增加幅度明顯，“贛引1號”、“貴栽1號”和“魯引1號”分別增加了88.87%、49.76%和112.60%，與對照和第4天的積累量相比均達到顯著性差異水平；干旱脅迫第16天時，3個品種的草石蠶MDA積累量達到最大，“贛引1號”、“貴栽1號”和“魯引1號”分別較對照增加了311.07%、150.71%和269.66%。由此可見，抗旱性強的“貴栽1號”升高幅度最小，抗旱性差的“贛引1號”升高幅度最大。

圖7 干旱脅迫對草石蠶MDA積累量的影響Fig.7 Effect of drought stress on MDA content of Stachys sieboldii Miq.

3 討論

3.1 干旱脅迫對植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱脅迫的主要生理機制，滲透調(diào)節(jié)最初是通過降低細胞內(nèi)部束縛水的自由能，從而盡量維持細胞內(nèi)外的水勢差，保證細胞在外界水勢很低的條件下繼續(xù)吸水，保證植物體內(nèi)水的平衡，使植物在干旱環(huán)境中能盡量正常的生長，彌補環(huán)境缺水對植物造成的影響，對干旱脅迫下植物的生長是非常有益的。干旱時植物呈缺水狀態(tài)，所以在干旱脅迫下植物會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細胞濃度[14]，降低細胞的滲透勢，增強植物從外界吸收水分的能力，以適應(yīng)干旱的環(huán)境[15-17]?？购的芰Σ煌闹参镌诟珊淡h(huán)境中積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力不同，所以通過研究滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累量可以從生理層面說明干旱對不同抗旱能力植物的影響，并解釋植物的抗旱能力與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量之間的聯(lián)系。植物細胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括Pro、可溶性糖和可溶性蛋白等。本研究測定了干旱脅迫條件下草石蠶葉片內(nèi)可溶性糖、蛋白、脯氨酸含量及其變化，擬具體解釋干旱對不同抗旱性植株的影響。

本試驗發(fā)現(xiàn)，隨干旱脅迫時間的延長，3種草石蠶可溶性糖含量一直升高，“贛引1號”的可溶性糖含量增加最多，“貴栽1號”增加最少。前期可溶性糖含量升高可能是因為干旱脅迫下植物光合系統(tǒng)的運轉(zhuǎn)機能受到影響，植物體內(nèi)大分子化合物的合成受到抑制，轉(zhuǎn)而合成低分子量的蔗糖等化合物[18]；而干旱脅迫后期，植物葉片的含水量大幅度降低，致使可溶性糖的相對濃度升高從而含量升高[19]，也可能是因為植物內(nèi)部機能遭到破壞，生命活動降低，導(dǎo)致對糖的消耗降低，最終使可溶性糖含量升高。本實驗中抗旱性強的“貴栽1號”可溶性糖含量增加最少的原因可能是干旱對其影響不大，此時的干旱程度對“貴栽1號”來說并不嚴重，只需通過積累相對較少的可溶性糖含量就能保證其在干旱逆境中生長，也可以說是因為“貴栽1號”葉片水分的喪失小于其他品種，所以其對可溶性糖積累的需要并不迫切，所以其對干旱的反應(yīng)表現(xiàn)不如其他品種明顯。

干旱脅迫時Pro的合成和積累會急劇增多，有時甚至?xí)黾訋资?，Pro的疏水端具有與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，親水端又可以和水結(jié)合，因此蛋白質(zhì)就可以利用Pro來束縛大量的水，防止脅迫條件下蛋白質(zhì)發(fā)生脫水現(xiàn)象，造成其性質(zhì)改變[17]，所以Pro對植物的生長有積極作用。本研究中3個品種的草石蠶隨著干旱脅迫時間延長，Pro積累量一直上升，前期是因為草石蠶積極調(diào)節(jié)內(nèi)部滲透物質(zhì)，以適宜外部干旱逆境，但隨干旱脅迫時間延長，Pro含量的增加很大程度上是因為葉片失水造成的。3個品種脯氨酸含量的變化趨勢與可溶性糖含量的變化一致，變化幅度與抗旱能力呈負相關(guān)。研究表明在干旱環(huán)境中，脯氨酸含量的變化與抗旱性的關(guān)系比較復(fù)雜，很多研究結(jié)果并不一致，所以本文3種草石蠶干旱逆境中脯氨酸含量的變化并不代表其他物種有相同的變化，植物的抗旱能力與很多因素有關(guān)，并不能單憑這一指標(biāo)說明問題。

植物中的蛋白質(zhì)是重要的有機物之一，主要以各種酶和貯藏蛋白的形式存在于植物體內(nèi)，在干旱脅迫下，植物的內(nèi)部調(diào)節(jié)系統(tǒng)會啟動與逆境有關(guān)的一些基因，從而合成脅迫蛋白來適應(yīng)逆境。本實驗中隨干旱脅迫時間延長，3個品種草石蠶可溶性蛋白含量均有所增加，與張明生等[20]對甘薯研究得到的結(jié)論一致，是植物對逆境做出的一種適應(yīng)性反應(yīng)，干旱脅迫時間達到一定程度時開始下降，這可能是由2個原因造成的，一是蛋白質(zhì)的合成能力降低[21]，二是分解速度加快[22]?？购敌詮姷摹百F栽1號”在試驗脅迫范圍內(nèi)，隨干旱脅迫時間延長，可溶性蛋白含量一直上升，說明其自我調(diào)節(jié)能力好，在試驗中的干旱逆境并沒有達到他的干旱適應(yīng)性臨界點，也就是說“貴栽1號”可以適應(yīng)更加嚴峻的干旱環(huán)境，它對干旱的忍受能力更強。

3種草石蠶的不同滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)的變化趨勢并不完全一致，但這并不矛盾，因為生物體內(nèi)的代謝反應(yīng)是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，一種物質(zhì)的變化受很多代謝反應(yīng)共同影響的結(jié)果，所以植物抗旱能力是植物體內(nèi)各種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，并不能以一種物質(zhì)的變化為標(biāo)準(zhǔn)來判斷。

3.2 干旱脅迫對植物抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫時植物會產(chǎn)生傷害植物細胞的活性氧，但是植物體內(nèi)具有清除活性氧的防御保護體系，植物體內(nèi)的活性氧自由基清除劑抗氧化酶體系(SOD、POD、CAT)，在逆境中能使植物通過提高其活性，來減少活性氧對植株的傷害，維持細胞膜的穩(wěn)定性。干旱脅迫下POD活性升高可以保護植物細胞膜的結(jié)構(gòu)，其活性升高的原因是活性氧的增加刺激了清除酶系統(tǒng)的活性[23]。SOD可以把植物體內(nèi)有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化物，再由POD和CAT轉(zhuǎn)化為無危害的水[24]。CAT可以清除細胞內(nèi)的有毒物質(zhì)，使細胞免受毒害[25]，所以3種酶的活性是鑒定植物抗逆性的重要指標(biāo)，酶活性越大清除危害物的能力就越大。本試驗不同草石蠶品種SOD、POD和CAT活性隨干旱脅迫時間的延長一直升高，說明在試驗脅迫范圍內(nèi)，草石蠶一直積極調(diào)動抗氧化酶活性降低細胞內(nèi)有毒物質(zhì)的積累，以適應(yīng)外界的干旱脅迫，但其調(diào)節(jié)能力是有限的，當(dāng)達到一定脅迫程度后，其活性會降低，失去調(diào)節(jié)能力，植物會受到嚴重傷害，從本試驗結(jié)果看，試驗范圍內(nèi)的脅迫還未達到這個程度。抗氧化酶的活性對植物對逆境的適應(yīng)有積極的影響，一般來說抗逆性好的植物的抗氧化酶活性比抗逆性差的植物的抗氧化酶活性要高，本實驗結(jié)果與此一致，抗旱能力強的“貴栽1號”的抗氧化酶活性高于另外2個品種。

3.3 干旱脅迫對植物體內(nèi)MDA含量的影響

MDA是植物細胞內(nèi)膜脂過氧化的產(chǎn)物，會引起細胞膜功能紊亂[26]，因此，MDA的積累量可作為評價植物在逆境下受傷害程度的重要指標(biāo)。MDA的積累量越少，植株受到的危害就越輕，抗性越好，MDA 的積累量越多，植物組織受到的傷害就越嚴重，抗性越差。本試驗中，3個草石蠶品種的MDA積累量變化情況不同，但均成一直升高的變化趨勢，這與在花生[27]、白樺[28]和紅松[29]等植物上的研究結(jié)果相似?？购敌詮姷摹百F栽1號”MDA積累量最少，所受傷害最小，而抗旱性差的“贛引1號”MDA積累量最多，植株受到的傷害最大。

文中3個草石蠶品種抗氧化酶活性的變化與MDA積累量的變化成負相關(guān)，結(jié)果與理論相符，正是由于高的酶活具有高的清除氧化產(chǎn)物的能力，才導(dǎo)致抗旱能力強的“貴栽1號”MDA積累量最低。

本文研究了3種不同抗旱性的草石蠶品種在干旱脅迫下，各生理指標(biāo)的變化，生理的最終作用表現(xiàn)在形態(tài)上，但是生理的變化是由分子層面的基因表達決定的，所以后期還可以做相關(guān)基因的熒光定量表達，進一步的解釋干旱對植株的影響。本文理論上從生理角度解釋了抗旱性不同的3種草石蠶在干旱環(huán)境下生理上的變化，從實際上為有關(guān)3種草石蠶的引種提供了參考依據(jù)。