孫梅 國(guó)東 趙琢 趙海英 付曉亮 葛全序 喬文革 王明義

作者單位：264200 山東威海，威海市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）又稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的綜合征，感染后直接損傷人類免疫系統(tǒng)功能，對(duì)人類健康造成巨大威脅。HIV屬RNA 病毒，電鏡下病毒顆粒呈球形，直徑100～120 nm。HIV 外層為脂蛋白包膜，gp120 和gp41 兩種特異糖蛋白鑲嵌在其中；內(nèi)部為20 面體對(duì)稱核衣殼，病毒核心含有RNA、反轉(zhuǎn)錄酶和核衣殼蛋白［1］。HIV 病毒廣泛存在于患者的血液、精液、陰道分泌物和乳汁中［2］，主要通過血液傳播、垂直傳播、母嬰傳播、性傳播等方式感染正常人群［3］，因此AIDS具有強(qiáng)大的傳染性，對(duì)人類社會(huì)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。美國(guó)疾病控制中心于1986 年將從HIV 初感染至進(jìn)展并診斷為AIDS 劃分為4 個(gè)時(shí)期，即急性感染期、無癥狀感染期（潛伏期）、AIDS 相關(guān)綜合征期、AIDS 期（AIDS 完全型）［4］。

正是由于HIV 的高致病性和高傳染性，對(duì)疑似HIV 感染者進(jìn)行早期篩查和診斷顯得尤為重要。目前主要檢測(cè)方法包括HIV 抗原檢測(cè)、HIV 抗體檢測(cè)、HIV 核酸檢測(cè)等，其中HIV 抗體檢測(cè)因操作便捷被廣泛應(yīng)用［5］。HIV 抗原測(cè)定和核酸定性檢測(cè)等作為抗體檢測(cè)的補(bǔ)充方法，是AIDS 早期診斷、輔助判別、病情監(jiān)測(cè)、選擇相應(yīng)臨床治療方案和藥物療效評(píng)估的重要依據(jù)。本研究針對(duì)近幾年HIV 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展和總體發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行闡述，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 抗體檢測(cè)

診斷HIV 感染的常規(guī)檢測(cè)方法是抗體檢測(cè)。根據(jù)適用范圍的不同，HIV 抗體檢測(cè)方法大致可分為兩種：初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)。初篩試驗(yàn)主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金快速檢測(cè)試驗(yàn)（rapid tests，RT）和微粒子化學(xué)發(fā)光法等；確認(rèn)試驗(yàn)主要包括蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot 法）、線性免疫試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)等，其中Western Blot 法最常用，被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。

1.1 ELISA 法 ELISA 法的應(yīng)用范圍最廣泛，適合用于大批量標(biāo)本的篩查。一般采用間接ELISA 法，原理為采用HIV抗原包被固相載體后與血清樣本相互發(fā)生作用，再利用酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體與底物的顯色反應(yīng)，檢測(cè)被測(cè)樣本中是否有HIV 抗體的存在。目前，ELISA 檢測(cè)相關(guān)試劑已發(fā)展至第4 代［6］。將完全病毒的裂解產(chǎn)物作為第1 代試劑的抗原，利用間接ELISA 法檢測(cè)有無抗體的存在，由于其中含雜質(zhì)較多，敏感性和特異性受到一定限制，出現(xiàn)較多假陽性結(jié)果。第2 代試劑的抗原為基因工程抗原，使用重組或合成的多肽抗原，檢測(cè)抗體采用的方法依舊是間接ELISA 法，但可同時(shí)檢測(cè)HIV-1、HIV-2，檢測(cè)方法的敏感性和特異性有所提升。與此同時(shí)，由于第2 代試劑采用的是基因工程抗原，這就造成重組抗原中存在載體組成部分的問題，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性。發(fā)展至第3 代試劑時(shí)，抗原使用人工合成帶有HIV 抗原決定簇的多肽，采用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體，第3 代試劑的一大優(yōu)勢(shì)為可探測(cè)出所有與HIV 抗原相關(guān)的抗體亞型，所以HIV 抗體檢測(cè)敏感性明顯升高，但仍會(huì)出現(xiàn)標(biāo)本漏檢的情況。HIV 抗原和抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑是HIV 抗體檢測(cè)的第4 代試劑，可一次性檢出p24 抗原、HIV-1 和HIV-2 抗體［7］。因?yàn)榈? 代試劑的敏感度較高，所以能在一定程度上縮短HIV 感染后檢測(cè)的窗口期。截至目前，我國(guó)主要使用第3代試劑，第4代試劑已被部分國(guó)家用于血源篩查。

1.2 RT 法 此技術(shù)的原理為利用硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的加樣區(qū)被特殊材料標(biāo)記的HIV 抗原包被，而硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)則用重組HIV-1和HIV-2抗原包被。如果此時(shí)患者標(biāo)本中存在HIV 抗體，則抗體會(huì)最先與被標(biāo)記抗原結(jié)合，經(jīng)相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，此物質(zhì)在層析作用下向前端移動(dòng)，與之前包被在檢測(cè)區(qū)的抗原發(fā)生反應(yīng)后結(jié)合，形成標(biāo)記HIV 抗原-重組HIV 抗原抗體復(fù)合物，發(fā)生顯色反應(yīng)顯色，有助于檢驗(yàn)人員判讀結(jié)果。RT 法結(jié)果的判斷：若檢測(cè)區(qū)與對(duì)照區(qū)均有一條紅線出現(xiàn)，則為HIV 抗體陽性；若僅對(duì)照區(qū)出現(xiàn)一條紅線，則認(rèn)為是HIV 抗體陰性；若檢測(cè)區(qū)與對(duì)照區(qū)均無紅色條帶的出現(xiàn)，則認(rèn)為此次試驗(yàn)無效。RT 法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判定，適合單份標(biāo)本的檢測(cè)［8］。

1.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）ECLIA 法的原理為在抗原或抗體上標(biāo)記發(fā)光的物質(zhì)或酶，待抗原或抗體的免疫反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入特定酶底物或氧化劑，再利用光電倍增管檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，由于發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中的復(fù)合物濃度呈一定線性關(guān)系，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)得待測(cè)樣本中的抗體含量［9］。因?yàn)樯锼?親和素技術(shù)、磁性微珠包被技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)等多種新穎檢測(cè)技術(shù)均在ECLIA 檢測(cè)中被綜合利用，所以ECLIA 法檢測(cè)HIV 抗體的敏感度在很大程度上得以提升，同時(shí)還使檢測(cè)過程更為標(biāo)準(zhǔn)化與自動(dòng)化，批內(nèi)和批間誤差明顯減少，檢測(cè)結(jié)果更精確可信［10］。

1.4 微粒子化學(xué)發(fā)光法 AutolumiS 3000 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀采用雙抗原夾心法，在磁微粒上標(biāo)記如gp41 和gp3的HIV 相關(guān)抗原，加入待測(cè)血清后發(fā)生反應(yīng)形成包被抗原-抗體結(jié)合物，溫浴后再加入被異魯米諾標(biāo)記的HIV 抗原，經(jīng)免疫反應(yīng)生成磁微粒標(biāo)記的抗原-抗體-異魯米諾標(biāo)記抗原復(fù)合物，通過以上反應(yīng)形成免疫反應(yīng)與發(fā)光之間的聯(lián)系。隨后在體系中加入激發(fā)液，繼而催化已被標(biāo)記HIV 抗原的異魯米諾在425 nm 處激發(fā)的光，這樣發(fā)光值（relative light unit，RLU）就與待測(cè)血清中HIV 抗體含量呈正相關(guān)，再根據(jù)樣本吸光度值/臨界值（S/CO 比值）對(duì)標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。該方法可批量上機(jī)實(shí)施自動(dòng)化分析檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，試劑穩(wěn)定性高，具有更好的檢測(cè)敏感性、穩(wěn)定性及重復(fù)性。

1.5 Western Blot 法 Western Blot 法是常用的HIV 抗體陽性確證試驗(yàn)，該方法將純化HIV 抗原裂解成不同的片段，通過凝膠電泳將抗原成分按分子質(zhì)量大小順序排列，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，借助酶標(biāo)抗體和底物使HIV 抗原顯色，再根據(jù)各條帶出現(xiàn)的位置判讀檢測(cè)結(jié)果，一般情況下出現(xiàn)2 條以上的條帶則能判定HIV 結(jié)果陽性［11］。Western Blot 法能顯示針對(duì)HIV 各抗原成分的抗體譜，敏感性和特異性較好，但操作步驟較多，對(duì)技術(shù)要求較高。有研究顯示，Western Blot 法也存在一定的弊端，會(huì)將僅有包膜蛋白（gp41+gp20/gp160）或gag+包膜（p24+gp41 或gp120/gp160）的部分人群判斷為HIV 陽性［12］。關(guān)于現(xiàn)有Western Blot 檢測(cè)漏檢的問題，多采用ELISA 法和Western Blot 法聯(lián)合檢測(cè)的方式判斷HIV 感染患者，必要時(shí)需補(bǔ)充核酸試驗(yàn)進(jìn)行確定［13］。

2 HIV 抗原檢測(cè)

HIV 的核心蛋白是p24 抗原?；颊吒腥綡IV 后，p24 抗原水平可隨病毒的不斷復(fù)制而升高，故p24 抗原在患者感染HIV 后14～21 d 即可被檢出，1～2 個(gè)月左右開始進(jìn)入抗原高峰，但隨后由于抗體的中和作用，游離性抗原逐漸減少，p24 抗原濃度持續(xù)降低，直至難以測(cè)出，此后人體HIV 抗體雖持續(xù)表現(xiàn)為陽性，卻進(jìn)入無癥狀感染期。所謂窗口期，即從機(jī)體感染HIV 至產(chǎn)生HIV 抗體的這段時(shí)間。HIV 感染后期p24 抗原濃度會(huì)隨HIV 的復(fù)制再度升高，所以p24 抗原檢測(cè)主要用于診斷HIV 的早期感染［14］，同時(shí)p24 抗原的濃度水平也可反映患者疾病的發(fā)展情況。針對(duì)HIV p24 的檢測(cè)方法包括ELISA 法、間接免疫熒光法、放射免疫分析等［15］。以ELISA 雙抗體夾心法最常用，原理為將已知的純化抗體包被在反應(yīng)孔板底部，若患者標(biāo)本中存在p24 抗原，則其與被包被的抗體發(fā)生相應(yīng)免疫反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，隨后再加入已被酶標(biāo)記過的HIV 抗體，與底物發(fā)生顯色反應(yīng)后，利用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。但該方法也存在假陽性的可能，需進(jìn)一步行確證實(shí)驗(yàn)加以確證。

3 HIV 核酸檢測(cè)

核酸檢測(cè)是目前檢測(cè)HIV 最敏感的方法。HIV 檢測(cè)分為定性和定量?jī)深悾ㄐ詸z測(cè)的主要作用是進(jìn)行HIV 感染的輔助診斷，而定量檢測(cè)則主要發(fā)揮對(duì)HIV 感染者的病情發(fā)展觀察和抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)作用。核酸檢測(cè)大致可分為核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、分支DNA雜交試驗(yàn)和熒光實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)等。理論上PCR 的敏感性和特異性較高，但由于擴(kuò)增倍數(shù)極大，微量的污染即可造成假陽性。目前應(yīng)用的PCR 自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)把PCR 的擴(kuò)增和檢測(cè)兩大步驟分別在單個(gè)反應(yīng)管內(nèi)分開進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)，可有效避免實(shí)驗(yàn)過程中的污染［16］。

4 CD4+、CD8+ T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)

T 淋巴細(xì)胞中的CD4+主要表示T 輔助細(xì)胞，而CD8+則代表T 抑制細(xì)胞和T 殺傷細(xì)胞。在人體免疫反應(yīng)過程中，CD4+T 淋巴細(xì)胞起著重要的作用。因?yàn)镠IV 病毒的主要靶細(xì)胞為CD4+淋巴細(xì)胞，所以人體感染HIV 病毒后的臨床改變主要為CD4+T 淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)減少，與此同時(shí)，CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量不斷增加，造成CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的比例失調(diào)［17］。CD4+T 淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)的數(shù)量隨著患者病情的加重明顯降低，人體的免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重破壞。因此CD4/CD8 比值是評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度和治療時(shí)機(jī)以及預(yù)后的指征之一，比值越低，表示細(xì)胞免疫缺陷的程度越嚴(yán)重。

5 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用

基因芯片技術(shù)，又稱DNA 芯片或生物芯片技術(shù)，是近幾年新興的生物技術(shù)。此技術(shù)的核心原理主要是在支持物上將特定探針分子進(jìn)行有規(guī)律地排布，再將探針分子與待測(cè)標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，利用激光共聚焦技術(shù)掃描芯片探測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和位置分布情況，再利用計(jì)算機(jī)軟件統(tǒng)計(jì)探針上的熒光信號(hào)，對(duì)其進(jìn)行對(duì)比分析從而得出結(jié)果。基因芯片檢測(cè)技術(shù)效率高、速度快，可在短時(shí)間內(nèi)獲得所需信息。早在1998 年，Hauser 等［18］就利用DNA 芯片技術(shù)在HIV 感染患者出現(xiàn)抗體反應(yīng)前從其體內(nèi)檢測(cè)到了HIV。由于基因芯片技術(shù)直接測(cè)定HIV 病原體，一定程度上解決了因基因變異和低拷貝樣本造成的漏檢問題，提高了樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性［19］。

6 展望

本文主要從HIV 抗體、HIV 抗原、HIV 核酸檢測(cè)、CD4+T 淋巴細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞、基因芯片5 個(gè)方面簡(jiǎn)要對(duì)HIV 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。AIDS 是目前國(guó)際公認(rèn)的最大公共危害之一，已對(duì)無數(shù)人造成嚴(yán)重的生理和心理損害。1985 年發(fā)現(xiàn)我國(guó)第1 例AIDS 確診患者，之后我國(guó)AIDS 感染者數(shù)量不斷增多，2010—2016 年我國(guó)AIDS 的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)；2017 年，我國(guó)AIDS 發(fā)病人數(shù)已升至57 194 例，數(shù)量約為2010 年發(fā)病人數(shù)的3 倍［20］。選擇HIV 檢測(cè)敏感度和特異度高的方法將有效避免臨床漏檢，有助于HIV 的早期診斷。

自1985 年第1 代HIV 抗體被發(fā)明以來，HIV 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了跨越式的進(jìn)步。目前分子生物技術(shù)得到快速發(fā)展，基因芯片和微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù)被廣泛應(yīng)用，HIV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)正朝著快速、高效、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的方向發(fā)展。相信隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，將不斷有新試劑和新方法用于HIV 檢測(cè)，使HIV 感染者在感染早期即可得到診斷。