李承范， 張敬東， 王思宏

( 延邊大學(xué) 測(cè)試中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

長(zhǎng)白紅景天(Rhodiolaangusta)為景天科紅景天屬多年生草本植物，其在吉林省主要分布在長(zhǎng)白、安圖、撫松等地，而且數(shù)量較少[1].研究[2]表明，紅景天屬植物具有抗疲勞、抗衰老以及提高免疫能力等方面的藥理功效，因此引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注.目前為止，有關(guān)長(zhǎng)白紅景天的研究多見(jiàn)于指紋圖譜[3-4]、無(wú)機(jī)元素[5]、解剖學(xué)[6]、內(nèi)生菌[7-8]、種群遺傳[9]等方面的研究，但對(duì)長(zhǎng)白紅景天根莖提取物的抗氧化性能的研究未見(jiàn)報(bào)道；因此，本文對(duì)長(zhǎng)白紅景天根莖提取物的抗氧化性能進(jìn)行研究，以期為長(zhǎng)白紅景天的藥用開(kāi)發(fā)提供參考.

1 材料及方法

1.1 材料

長(zhǎng)白紅景天采于安圖縣二道白河，并經(jīng)長(zhǎng)白山植物博物館鑒定；蘆丁，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)； 1,1-二苯代苦味?；杂苫?1,1-dipenyl-2-picrylhydray,DPPH)、特丁基對(duì)苯二酚(Tertiary butylhydroquinone,TBHQ)、抗壞血酸(Vc)、二丁基羥基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)、三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl 緩沖液)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)，Sigma公司生產(chǎn)；鄰二氮菲、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、鹽酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，且均為分析純.

1.2 主要儀器

U-3400型紫外分光光度計(jì)，Hitachi公司生產(chǎn)； sp210s型電子天平，北京賽多利天平有限公司生產(chǎn)； Q/BKYY31-200型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海青浦滬西儀器廠(chǎng)生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1總黃酮的提取 將乙醇濃度、浸提溫度、料液比、浸提時(shí)間作為影響總黃酮提取量的因素，利用正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，各實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示.表2為總黃酮提取因素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表.

表1 總黃酮提取因素水平

表2 總黃酮提取因素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：Ki表示任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和；ki是每列對(duì)應(yīng)值之和的三分之一；R表示極差.

由表2可知，影響提取總黃酮的工藝因素依次為：提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間.由此可知，提取長(zhǎng)白紅景天時(shí)，加40倍長(zhǎng)白紅景天質(zhì)量的乙醇(體積分?jǐn)?shù)為80%), 在95 ℃條件下加熱提取1 h，提取效果最佳.

1.3.2總黃酮含量的測(cè)定 稱(chēng)取55 mg蘆丁置于50 mL容量瓶中，加入適量的乙醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)，微熱溶解后定容至50 mL，質(zhì)量濃度為110 μg/mL.移取蘆丁溶液0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0、 4.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)、4 mL氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%)，然后用乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為70%)定容至刻度.參比液為0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)和4 mL氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%).在510 nm處，測(cè)量蘆丁溶液的吸光度.以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并得到濃度與吸光度的線(xiàn)性關(guān)系.線(xiàn)性回歸方程為：y=-0.008 19x+0.010 01，R2=0.994 5.

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

用正交試驗(yàn)得到的最佳條件提取長(zhǎng)白紅景天(2 g) 2次，并合并提取液，過(guò)濾后轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中定容.取3份1 mL提取液分別置于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)、4 mL氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%)，搖勻后用乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為70%)定容至刻度.以蒸餾水為空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定提取液的吸光度.

1.3.3DPPH自由基的清除率測(cè)定 用移液管移取不同濃度提取液0.5 mL，加入1.5 mL乙醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)后置于10 mL試管中，再加入2.0 mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)； 充分混勻，靜置30 min后在517 nm條件下測(cè)定其吸光度Ai.將2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL乙醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)溶液混合，搖勻，靜置5 min后測(cè)定其吸光度Ac.將2 mL提取液(不同濃度)與2 mL乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為70%)混合，搖勻，靜置后測(cè)定其吸光度Aj.根據(jù)公式(1)計(jì)算提取物對(duì)DPPH自由基的清除率(RSRDPPH)，并在相同條件下計(jì)算TBHQ、Vc和BHT的DPPH自由基清除率.

(1)

1.3.4羥基自由基的清除率測(cè)定 取9支試管，依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、3.5 mL pH=7.4的PBS和1.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液.在其中的7支試管中，分別加入不同濃度的提取液0.5 mL，混勻，靜置.將剩余2支不加提取液的試管分別標(biāo)記為損傷管和未損傷管，并在損傷管中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為0.01%的雙氧水溶液(未損傷管中不加雙氧水溶液).再將9支試管用蒸餾水稀釋至10 mL， 37 ℃恒溫1 h后用同濃度提取液做參比液，在536 nm處測(cè)定吸光度.根據(jù)公式(2)計(jì)算提取物對(duì)羥基自由基的清除率(RSR·OH)，并在相同條件下計(jì)算TBHQ、Vc和BHT的羥基自由基清除率.

(2)

式中A2為未損傷管中溶液的吸光度，A1為損傷管中溶液的吸光度，A0為提取液的吸光度.

(3)

式中A0為加入提取液之前的鄰苯三酚自氧化的吸光度，A1為加入提取液之后的鄰苯三酚自氧化的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮提取工藝優(yōu)化的結(jié)果分析

按照最佳提取工藝提取長(zhǎng)白紅景天，測(cè)得所得提取物的總黃酮含量為3.74%,這與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中實(shí)驗(yàn)8 (表2)接近，表明此工藝條件是合理、可行的.

2.2 長(zhǎng)白紅景天提取物抗氧化性能的測(cè)試

1) 對(duì)DPPH自由基清除能力的考察.長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖2所示.由圖2可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)白紅景天提取物對(duì)DPPH自由基的清除率均保持在90%～95%之間，與Vc較為接近，且優(yōu)于TBHQ和BHT.

圖2 長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)DPPH自由基的清除率

2)對(duì)羥基自由基清除能力的考察.長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)羥基自由基的清除能力如圖3所示.由圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)白紅景天提取物對(duì)羥基自由基的清除率基本隨濃度的增加而增加，清除率保持在63%～100%之間；Vc、TBHQ和BHT在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除率保持在40%～60%之間.這說(shuō)明，長(zhǎng)白紅景天提取物對(duì)羥基自由基的清除活性?xún)?yōu)于Vc、TBHQ和BHT.

圖3 長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)羥基自由基的清除率

3)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力的考察.長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力如圖4所示.由圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)超氧陰離子自由基的清除率范圍分別為： 27%～50%、15%～32%、22%～32%、 21%～30%，這表明長(zhǎng)白紅景天提取物在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率優(yōu)于Vc、TBHQ和BHT.

圖4 長(zhǎng)白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對(duì)超氧負(fù)離子自由基的清除率

3 結(jié)論

本文研究表明，長(zhǎng)白紅景天提取物總黃酮提取工藝的最佳條件是加40倍長(zhǎng)白紅景天質(zhì)量的乙醇(體積分?jǐn)?shù)為80%),在95 ℃條件下加熱提取1 h.在最佳工藝條件下，測(cè)得長(zhǎng)白紅景天提取物中總黃酮的含量為3.74%.長(zhǎng)白紅景天提取物在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)3種自由基(DPPH、羥基、超氧陰離子)均有較好的清除能力，且對(duì)3種自由基的清除能力均優(yōu)于Vc、TBHQ和BHT.另外，長(zhǎng)白紅景天提取物對(duì)DPPH的清除能力也優(yōu)于玫瑰紅景天(R.roseaL.)[10]：因此，長(zhǎng)白紅景天是一種優(yōu)良的抗氧化活性的植物.本文在研究中未對(duì)提取物中的抗氧化單體化合物進(jìn)行分離和鑒定，今后將對(duì)此進(jìn)行研究.