章萍

[摘要]目的 研究肝癌患者組織中非編碼微核糖核酸-375（miR-375）的表達(dá)情況。方法 選取2014年7月～2018年12月在我院進(jìn)行手術(shù)切除治療的77例肝癌患者作為研究對(duì)象，提取患者癌組織標(biāo)本中的非編碼微核糖核酸（miRNAs）進(jìn)行考察，以癌旁正常組織作為對(duì)照。觀察肝癌組織、癌旁組織中的miR-375表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果 77例肝癌患者的癌組織中miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同性別、年齡、肝功能Child-pugh分級(jí)、體力狀況（ECOG）評(píng)分、病灶數(shù)量、巴塞羅那（BCLC）分期肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腫瘤直徑≥5 cm肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于腫瘤直徑<5 cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-375相對(duì)表達(dá)水平與患者的腫瘤直徑成負(fù)相關(guān)（r=-4.521，P<0.05）。結(jié)論 肝癌患者組織中miR-375的表達(dá)水平同腫瘤直徑存在密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]肝癌;組織;miR-375;表達(dá)水平

[中圖分類號(hào)] R735.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2019）12（c）-0029-04

Expression analysis of non-coding microRNA-375 in tissues of patients with liver cancer

ZHANG Ping

Department of Pathology， the Ninth Hospital of Nanchang City， Jiangxi Province， Nanchang ? 330002， China

[Abstract] Objective To study the expression of non-coding microRNA-375 （miR-375） in tissues of patients with liver cancer. Methods Seventy-seven patients with liver cancer who underwent surgical resection in our hospital from July 2014 to December 2018 were selected as subjects in this study. The non-coding microRNAs （miRNAs） from these cancer patients were extracted. The normal tissues near to cancer ones were selected as control. The expression levels of miR-375 in liver cancer tissues and normal tissues were observed and compared. Results The relative expression level of miR-375 in the cancer tissues of 77 patients with liver cancer was lower than that in the normal tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. The relative expression levels of miR-375 in liver cancer tissues of different genders， age， Child-pugh liver function grading， physical status （ECOG） scores， number of lesions， and Barcelona （BCLC） stage were compared， and the differences were not statistically significant （P>0.05）. The relative expression level of miR-375 in liver cancer tissues with tumor diameter ≥5 cm was lower than that of tumor diameter <5 cm， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The relative expression level of miR-375 was negatively correlated with tumor diameter （r=-4.521， P<0.05）. Conclusion The expression level of miR-375 in liver cancer patients is closely related to tumor diameter.

[Key words] Liver cancer; Tissue; miR-375; Expression level

肝癌是惡性腫瘤中發(fā)病率較高的一種[1]，且具有較高的惡性程度，病情發(fā)展快且治療難度大，會(huì)對(duì)患者的生命安全構(gòu)成極大的威脅。非編碼微核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[2]，其在多種生理、病理過程中，如細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化等，均發(fā)揮著顯著作用。miRNA具有癌基因、抑癌基因的作用（可扮演癌基因和抑癌基因的角色），其參與了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[3]。在肝癌患者的肝細(xì)胞、外周血清中，有多種miRNA表達(dá)的改變存在，異常表達(dá)miRNA的發(fā)現(xiàn)為臨床豐富對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)、探索新的基因靶向治療方案提供了指導(dǎo)[3]。另外miRNA表達(dá)同肝癌的病理類型、惡性程度、分期、分級(jí)等病理過程存在密切關(guān)系，但不同的miRNA類型在肝癌中所發(fā)揮的作用存在差異，本研究選取在我院進(jìn)行手術(shù)切除治療的77例肝癌患者作為研究對(duì)象，旨在分析肝癌組織中非編碼微核糖核酸-375（miR-375）的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年7月～2018年12月在我院進(jìn)行手術(shù)切除治療的77例肝癌患者作為研究對(duì)象，提取患者癌組織標(biāo)本中的miRNAs進(jìn)行考察，以癌旁正常組織作為對(duì)照。77例肝癌患者中，男73例，女4例;年齡26～70歲，平均（43.34±2.86）歲;肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)62例，B級(jí)15例;體力狀況（ECOG）評(píng)分：0分47例，1分22例，2分5例，3分3例;腫瘤直徑：≥5 cm 61例，<5 cm 16例;病灶數(shù)量：單發(fā)45例，多發(fā)32例;巴塞羅那（BCLC）分期：A期41例，B期17例，C期19例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)臨床評(píng)估、影像學(xué)檢查、病理檢查明確診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，存在肝炎后肝硬化病史;②所有患者均進(jìn)行肝癌切除手術(shù)，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療;③所有患者術(shù)后自愿接受隨訪，且隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有繼發(fā)轉(zhuǎn)移性肝癌、惡性腫瘤的患者;②存在嚴(yán)重感染、血液系統(tǒng)疾病的患者;③處于妊娠期、哺乳期的患者。本次研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者均自愿簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1儀器、試劑盒 ?試劑盒包括miRNA提取分離試劑盒及擴(kuò)增試劑盒，儀器主要包括熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀。

1.2.2肝癌組織標(biāo)本中miRNA提取方法 ?采用miRNA提取分離試劑盒，按照標(biāo)簽的加入量，加入無水乙醇去鹽的漂洗液（RW）、去蛋白液的漂洗液（MRD）中。注意采集的癌組織與正常肝組織應(yīng)距離3 cm以上。

1.2.3檢測方法 ?應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測，逆轉(zhuǎn)錄miR-375、U6;逆轉(zhuǎn)錄體積為155 μl，在42℃的條件下孵育30 min，在85℃的條件下孵育5 min。之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到循環(huán)閾值（Ct），內(nèi)參為U6，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-375的相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察肝癌患者的miR-375表達(dá)情況以及臨床病理參數(shù)情況，通過相關(guān)性分析探討miR-375表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

肝功能Child-Pugh分級(jí)是一種對(duì)肝硬化患者肝臟儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)估的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，等級(jí)越高，提示患者的肝臟儲(chǔ)備功能越差，預(yù)后越差。ECOG評(píng)分，是從患者的體力來了解其一般健康狀況和對(duì)治療耐受能力的指標(biāo)。ECOG體力狀況評(píng)分分值越低，提示患者的體力狀況越好。BCLC分期是一種肝癌臨床分期系統(tǒng)，A期是指早期，B期是指中期，C期是指晚期。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析;采用Pearson系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-375表達(dá)情況

77例肝癌患者的癌組織中miR-375相對(duì)表達(dá)水平為（4.50±1.38），癌旁正常組織中的miR-375表達(dá)水平為（13.67±3.52）?；颊叩陌┙M織中miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.283，P=0.001）。

2.2肝癌組織miR-375表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同性別、年齡、肝功能Child-Pugh分級(jí)、ECOG評(píng)分、病灶數(shù)量、BCLC分期肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但腫瘤直徑≥5 cm肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于腫瘤直徑<5 cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 miR-375相對(duì)表達(dá)水平與肝癌腫瘤直徑的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-375相對(duì)表達(dá)水平與肝癌腫瘤直徑成負(fù)相關(guān)（r=-4.521，P<0.05），即miR-375相對(duì)表達(dá)水平越低，腫瘤直徑越大。

3討論

miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的、具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其參與了各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等[4-6]，其通過結(jié)合靶基因3端非翻譯序列來對(duì)靶基因降解、抑制目標(biāo)mRNA翻譯過程進(jìn)行抑制，進(jìn)而對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行抑制[7];其還能對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通路、促癌基因（IGF）-Ⅱ和腫瘤細(xì)胞胰島素樣生長因子受體（ICF-IR）表達(dá)等調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡進(jìn)行調(diào)控[8-9]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。

miR-375是一種抑癌基因，其與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后存在密切的關(guān)系[10-11]。miR-375在惡性腫瘤中呈低水平表達(dá)會(huì)促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲以及轉(zhuǎn)移，臨床將miR-375作為癌癥治療靶點(diǎn)以及判斷預(yù)后的重要標(biāo)志之一[12]，在癌癥治療中具有重要意義。以往認(rèn)為miR-375能夠調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌，之后發(fā)現(xiàn)miR-375在消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、婦科、口腔等腫瘤組織中呈低表達(dá)，且均比癌旁組織中的miR-375表達(dá)水平低，少數(shù)腫瘤組織的miR-375表達(dá)水平高于癌旁組織[13]。通過分析發(fā)現(xiàn)，miR-375具有諸多的作用：①其可以抑制肝癌新生血管的生成[14]：miR-375過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致新生血管管腔形成密度減少;同時(shí)減少微血管出芽數(shù)目，進(jìn)而能夠?qū)?xì)胞的增殖、克隆形成、遷徙或侵襲能力進(jìn)行抑制。②miR-375可對(duì)肝癌細(xì)胞中血小板源性生長因子（PDGFC）的表達(dá)進(jìn)行抑制，miR-375過表達(dá)、下調(diào)表達(dá)可對(duì)PDGFC基因表達(dá)進(jìn)行有效抑制、促進(jìn)[15]。③miR-375在血小板源性生長因子非編碼端（PDGFC3′-UTR）上特異性靶位點(diǎn)沉默PDGFC基因上直接作用，進(jìn)而對(duì)PDGFC基因表達(dá)進(jìn)行抑制，且能夠抑制腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下清除損傷的線粒體。miR-375同PDGFC基因在肝癌組織中的表達(dá)為負(fù)相關(guān)[16-17]，能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞的生長進(jìn)行抑制miR-375通過靶向關(guān)鍵性的自噬相關(guān)分子抑制了低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的自噬[18-19]，并削弱其在低氧狀態(tài)下的活性，說明通過調(diào)控miR-375干預(yù)低氧狀態(tài)下肝癌細(xì)胞的自噬有望成為一種潛在的抗肝癌新策略。

本研究結(jié)果顯示，77例肝癌患者的癌組織中miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示癌旁正常組織中的miR-375充分發(fā)揮了抑癌作用，可阻止腫瘤細(xì)胞血管的生成。另外本研究結(jié)果還顯示，不同性別、年齡、肝功能Child-Pugh分級(jí)、體力狀況（ECOG）評(píng)分、病灶數(shù)量、巴塞羅那（BCLC）分期的肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腫瘤直徑≥5 cm的肝癌組織中的miR-375相對(duì)表達(dá)水平低于腫瘤直徑<5 cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-375相對(duì)表達(dá)水平與肝癌腫瘤直徑成負(fù)相關(guān)（r=-4.521，P<0.05）。這是因?yàn)閙iR-375水平的降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，無法較好地抑制腫瘤細(xì)胞向周圍正常組織侵襲、轉(zhuǎn)移，因此會(huì)增加腫瘤體積和直徑。徐曉宏等[20]在其文章中提到，miR-200a、miR-148b、miR-375在原發(fā)性肝癌組中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且miR-375會(huì)對(duì)p53、p21、PTEN等重要生物學(xué)途徑產(chǎn)生影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著乙肝表面抗原（HBsAg）表達(dá)水平的升高，miR-375表達(dá)水平會(huì)隨之下降，另外在肝癌的診斷中，血清miR-375的診斷敏感性、特異性比癌抗原19-9（CA19-9）高。結(jié)合本研究結(jié)果，可知調(diào)高miR-375表達(dá)水平有助于手術(shù)治療效果的提高，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而降低復(fù)發(fā)率;當(dāng)肝癌患者體內(nèi)抑癌基因miR-375表達(dá)水平降低時(shí)，可通過分子靶向治療來恢復(fù)患者體內(nèi)組織的miR-375正常表達(dá)量，有助于患者生存期的延長，可將其作為腫瘤的治療靶點(diǎn)之一。

綜上所述，miR-375在肝癌中呈低表達(dá)水平，參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展，通過檢測miR-375水平，可為臨床治療、診斷、預(yù)后判斷提供有效的幫助。但本次研究中由于隨訪時(shí)間短，未對(duì)miR-375表達(dá)水平與肝癌患者生存率的關(guān)系進(jìn)一步研究，有待于今后進(jìn)行考察。

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（收稿日期：2019-04-19 ?本文編輯：孟慶卿）