盧美 鄒翔 萬圣 楊瑞軍 杜海娟 張劍鋒

血吸蟲病是嚴(yán)重危害我國人民健康和生命安全、影響經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的一種人畜共患傳染病。感染性釘螺的分布情況是血吸蟲病監(jiān)測的重要內(nèi)容，及時(shí)掌握感染性釘螺的變化趨勢對(duì)開展血防工作、保護(hù)疫區(qū)人群健康非常必要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是近年來新出現(xiàn)并發(fā)展起來的一種敏感、特異、方便快捷的鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)，可作為病原體所致的感染性疾病早期檢測和鑒定的一種簡單而快速的診斷工具。整個(gè)過程非常簡單而且迅速，僅需在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入所有反應(yīng)試劑，利用針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的特異性LAMP引物，在60～65℃恒溫的條件下即可完成。本研究對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測日本血吸蟲感染性釘螺方法進(jìn)行優(yōu)化，并在開化縣感染性釘螺監(jiān)測現(xiàn)場進(jìn)行應(yīng)用評(píng)價(jià)。

材料和方法

一、LAMP技術(shù)優(yōu)化

1.材料與試劑

日本血吸蟲感染性釘螺購于江蘇省血吸蟲病防治研究所；Bst聚合酶、Bst DNA Polymerase Buffer 10×(Tris-HCL 200 mM，KCl 100 mM，(NH4)2SO4100 mM，Triton X-100 1%)、Betaine、SYBR Green I、dNTP、MgSO4等試劑均購于上海生物工程股份有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(批號(hào)R6907)。

2.引物合成

根據(jù)已公布的日本血吸蟲尾蚴基因及相關(guān)參考文獻(xiàn)(引物01-SjR2參考余傳信等[1]，02-SjR28參考Kumagai T等[2]，03-CaBP參考鄧鵬程等[3])，由上海生物工程股份有限公司合成3組LAMP引物，具體序列見表1。

3.模板DNA的制備

壓片鏡檢釘螺，如陽性，則收集釘螺軟體組織及剩余液體。收集的樣本用DNA提取試劑盒提取總核酸(具體步驟參照試劑盒說明書)，提取的DNA樣本4℃(1周內(nèi))或-20℃(長期)凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.LAMP反應(yīng)體系及其優(yōu)化

LAMP 擴(kuò)增基礎(chǔ)反應(yīng)體系(50 μL)：模板DNA 2 μL，外引物(FIP、BIP，40.0 μM)2 μL，內(nèi)引物(F3、B3，10.0 μM)1 μL，Betaine(5.0 M) 10 μL，dNTP(10.0 μM) 7 μL，MgSO4(150.0 μM)3 μL，Buffer(10 ×) 5 μL，Bst DNA Polymerase(8.0 U/μL)2 μL，dd H2O 18 μL。

(1)引物優(yōu)化

參照基礎(chǔ)反應(yīng)體系，分別加入3組引物(分別是01-SJR2、02-SjR28、03-CaBP，詳見表1)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，混勻后65℃水浴孵育60 min，85 ℃ 5 min滅活,LAMP反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳。

(2)溫度影響

參照基礎(chǔ)反應(yīng)體系，加入引物02- SjR28，調(diào)節(jié)水浴溫度分別為65℃、64℃、63℃、62℃、61℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。反應(yīng)終產(chǎn)物測吸光度并進(jìn)行電泳。

表1 日本血吸蟲尾蚴 LAMP 寡核苷酸引物序列

(3)Mg2+濃度的影響

參照基礎(chǔ)反應(yīng)體系，加入引物02- SjR28，調(diào)節(jié)Mg2+濃度分別為6.6 mM (2.2 μL)、7.8 mM (2.6 μL)、9.0 mM (3.0 μL)、10.2 mM(3.4 μL )，反應(yīng)時(shí)間為60 min。反應(yīng)終產(chǎn)物測吸光度。

5.反應(yīng)終產(chǎn)物檢測

(1)吸光度檢測

將反應(yīng)終產(chǎn)物加入到96孔板內(nèi)，620 nm波長測OD值。

(2)電泳檢測

將反應(yīng)終產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，1.5%瓊脂糖凝膠，100 V電泳約60 min。

二、LAMP法檢測釘螺方法學(xué)評(píng)價(jià)及現(xiàn)場應(yīng)用

1.檢測樣本

對(duì)全縣發(fā)現(xiàn)的螺點(diǎn)進(jìn)行整群抽樣檢測，抽查3個(gè)有螺鄉(xiāng)，每鄉(xiāng)各抽查2個(gè)螺點(diǎn)，每個(gè)螺點(diǎn)檢測釘螺樣本1 000只(不足1 000只全部檢測)。另購買江西、江蘇兩省的陽性釘螺，每省30只。

2.檢測方法

同一螺點(diǎn)釘螺同時(shí)采用壓片法與優(yōu)化后LAMP法開展平行檢測。

每200只釘螺為1組，1個(gè)螺點(diǎn)分成5個(gè)小組，在5個(gè)小組中隨機(jī)加1～5個(gè)陽性釘螺，先由壓片鏡檢人員進(jìn)行檢測，之后交由LAMP檢驗(yàn)人員進(jìn)行檢測，比較兩者的差異(壓片檢驗(yàn)人員與LAMP檢驗(yàn)人員事先都不知道結(jié)果，且兩者不能溝通，達(dá)到盲法的目的)。

3.LAMP法與壓片法的比較

記錄LAMP法與壓片法所需的時(shí)間、儀器設(shè)備、主要步驟、結(jié)果判斷和操作等。

結(jié) 果

一、LAMP技術(shù)優(yōu)化

1.擴(kuò)增引物優(yōu)化

引物02- SjR28組試驗(yàn)結(jié)果最佳，呈現(xiàn)清晰的LAMP 特征性梯狀條帶；03-CaBP 組結(jié)果次之，電泳條帶較模糊，條帶淡；01-SjR2組LAMP特征性梯狀條帶最弱。見圖1。

M：Marker；1-3：01-SjR2；4：02- SjR28；5：03-CaBP

圖1不同引物L(fēng)AMP反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.溫度影響

水浴溫度分別為65℃、64℃、63℃、62℃、61℃時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物吸光度為0.204、0.201、0.126、0.059、0.035，反應(yīng)終產(chǎn)物吸光度在65℃時(shí)吸光度最高，電泳條帶亮度在65℃時(shí)最亮。

3.Mg2+濃度的影響

Mg2+濃度分別為6.6、7.8、9.0、10.2 mM時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物吸光度為0.223、0.246、0.210、0.108，Mg2+濃度在7.8 mM時(shí)焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生最多。

表2 LAMP技術(shù)與壓片法的比較

二、LAMP技術(shù)與壓片法檢測感染性釘螺效果評(píng)價(jià)

1.LAMP技術(shù)與壓片法的比較

單個(gè)釘螺檢測采用LAMP技術(shù)所需時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過壓片法，但當(dāng)釘螺檢測數(shù)量大于1 000個(gè)時(shí)，LAMP技術(shù)所需時(shí)間較短。LAMP技術(shù)所需的實(shí)驗(yàn)步驟和儀器設(shè)備較壓片法更為復(fù)雜，結(jié)果判斷LAMP技術(shù)可靠肉眼直接判斷，壓片法則需要利用解剖顯微鏡。LAMP技術(shù)僅能對(duì)感染性釘螺和尾蚴進(jìn)行定性判斷，壓片法則可進(jìn)行定性和定量判斷。見表2。

2.LAMP技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用評(píng)價(jià)

于新源村、門村村、王畈村、華東村、華尾村和蕉荷村分別檢獲998、995、990、332、433、295只釘螺，再分別加入2、5、10、2、3、2只陽性釘螺，同時(shí)采用LAMP法和壓片法檢測，每個(gè)螺點(diǎn)檢測結(jié)果均為陽性。

討 論

開化縣曾是血吸蟲病歷史重度流行縣，經(jīng)過五十多年的綜合防治，于1995年達(dá)到血吸蟲病傳播阻斷標(biāo)準(zhǔn)，于2016年通過血吸蟲病消除狀態(tài)復(fù)核評(píng)估但開化縣仍存在釘螺，釘螺面積徘徊在3 hm2～5 hm2，外出務(wù)工返鄉(xiāng)人員較多，且與江西、安徽兩省毗鄰，存在著外來傳染源輸入和血吸蟲病重新傳播流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

感染性釘螺是血吸蟲病監(jiān)測的重要內(nèi)容，目前常規(guī)的監(jiān)測方法為壓碎鏡檢法和逸蚴法，而這兩種方法常發(fā)生漏檢。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法具有敏感性高等特點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于一些病原體的檢測[5～10]。為克服傳統(tǒng)查螺方法的缺點(diǎn)，本文對(duì)LAMP技術(shù)監(jiān)測感染性釘螺的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化[11～15]，通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，選擇02-SjR28引物作為最優(yōu)引物，65℃作為最適反應(yīng)溫度，7.8 mM作為最適Mg2+濃度；同時(shí)對(duì)優(yōu)化后的方法開展現(xiàn)場評(píng)價(jià)，LAMP技術(shù)與壓碎鏡檢法鑒定結(jié)果完全相符。與壓碎鏡檢法相比，LAMP技術(shù)結(jié)果觀察方便，定性準(zhǔn)確，但檢測少量釘螺時(shí)LAMP法所花費(fèi)的時(shí)間較壓碎鏡檢法多，只有大規(guī)模檢測時(shí)相對(duì)耗時(shí)較少。設(shè)備不方便攜帶，且核酸提取條件要求高是限制LAMP法在基層推廣應(yīng)用的關(guān)鍵性因素，因此，有必要簡化核酸提取，以便于LAMP技術(shù)在基層推廣。