連智雯 張 麗 竇曹帥，3 張 鴻 柯貴寶 陳雪芹,3 李 卓馬建超 廖如意 何朝生 梁馨苓 劉雙信1,,3

足細(xì)胞損傷是多種腎臟病發(fā)生的重要原因，但其損傷機(jī)制尚未完全清楚。國內(nèi)[1-4]和國外[5-7]研究結(jié)果表明T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1) 活化是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、凋亡、腎小球硬化的重要原因。生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43，GAP-43)是神經(jīng)組織特異性表達(dá)的蛋白，是鈣激活蛋白家庭的一員,可調(diào)節(jié)Ca2+流量及鈣調(diào)蛋白的效力[8]，在第二信使信號通路中參與信號傳遞[9]。研究表明鈣調(diào)磷酸酶(CaN)-NFAT 信號軸活化參與足細(xì)胞損傷、凋亡和腎小球硬化[5-7]。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)[11-12]、心臟[13]等領(lǐng)域得到廣泛研究，然而在腎臟中表達(dá)及效應(yīng)尚無報(bào)道。本研究擬通過人類腎小球疾病及脂多糖(LPS)損傷細(xì)胞模型觀察GAP-43在足細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步探究GAP-43對足細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制。

材料與方法

儀器和試劑RMPI 1640培養(yǎng)基(CORNING)；胎牛血清(Gibco)、0.05%胰酶；核漿蛋白提取試劑盒(凱基)；γ干擾素(ProSpec)； histone 抗體(CST)；GAP-43 抗體、NFATc1、nephrin、CaN(Abcam)；Synaptopodin 抗體(Santa)；熒光二抗488、熒光二抗555(Thermo)；腺病毒HBAD-m-Gap43-3xflag-GFP(漢恒生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol(Life Tech-nologies)；LPS(Sigama);β-actin抗體(Affinity)。

足細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組條件永生化小鼠足細(xì)胞系由Rush University Medical Center 惠贈。足細(xì)胞復(fù)蘇后用含(2～4)×104U/L 重組小鼠γ 干擾素及5%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基先在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中分化。37℃培養(yǎng)9～11d 后，足細(xì)胞分化成熟。本實(shí)驗(yàn)所有足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)為明確LPS誘導(dǎo)GAP-43的時(shí)間效應(yīng)，分組如下：LPS(100 μg /ml)培養(yǎng)刺激0h、24h、48h、72h；(2)為探討過表達(dá)GAP-43對足細(xì)胞nephrin表達(dá)、活動性及NFATc1 核內(nèi)表達(dá)的影響，分組如下:正常對照組；LPS組：無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后LPS刺激72h；過表達(dá)對照組(vector+LPS 組):無血清培養(yǎng)液及5 μl對照病毒(vector)干預(yù)24h后LPS刺激72h;過表達(dá)組(GAP-43+LPS組):無血清培養(yǎng)液及5 μl過表達(dá)GAP-43腺病毒(HBAD-m-Gap43-3xflag-GFP)干預(yù)24h后LPS干預(yù)72h。

免疫熒光正常腎組織標(biāo)本取自于腎癌患者手術(shù)切除的鄰近正常腎組織，微小病變型腎病(MCD)、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、膜性腎病(MN)腎組織標(biāo)本取自廣東省人民醫(yī)院腎內(nèi)科腎活檢標(biāo)本。將細(xì)胞或腎組織冰甲醇固定、0.5% Triton X-100透化10 min、5%FBS蛋白封閉30 min，然后滴加一抗過夜,避光加入相應(yīng)的熒光二抗,封片,通過激光共聚焦顯微鏡觀察。其中腎小球疾病患者足細(xì)胞，是在腎活檢組織免疫熒光染色中通過足細(xì)胞標(biāo)記蛋白Synaptopodin來標(biāo)記足細(xì)胞。

Western印跡細(xì)胞成熟后加入蛋白裂解液(提取核蛋白加入核蛋白裂解液)刮取蛋白，測量蛋白濃度，加入變性液98℃ 10 min 變性蛋白。制備合適濃度Western膠后，蛋白上樣，80V電泳，恒流200 mA、2h電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%牛奶封閉30 min，加入相應(yīng)一抗二抗孵育,化學(xué)發(fā)光液曝光，Image J軟件分析灰度值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測定濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作檢測目的基因表達(dá)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，定量結(jié)果取平均值。引物序列如下：GAP-43正義鏈5′-A-C-C-A-C-C-A-T-G-C-T-G-T-G-C-T-G-T-A-T-G-A-G -3′，反義鏈5′-T-C-C-G-G-C-T-T-G-A-C-A-C-C-A-T-C-T-T-G -3′；β-actin正義鏈5′-G-C-T-T-C-T-A-G-G-C-G-G-A-C-T-G-T-T-A-C -3′，反義鏈5′-C-C-A-T-G-C-C-A-A-T-G-T-T-G-T-C-T-C-T-T -3′。

病毒感染37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中二次分化的足細(xì)胞分化成熟之后，向含有5 ml無血清的培養(yǎng)液中加入5 μl的腺病毒液(HBAD-m-Gap43-3xflag-GFP)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，感染24h后，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，換成普通含有5%血清的培養(yǎng)液，再做其他干預(yù)。

劃痕實(shí)驗(yàn)將已分化成熟的足細(xì)胞接種到六孔板，5% CO2、37℃孵育過夜。用1 ml無菌吸頭末端刮除每孔蓋玻片上的細(xì)胞，刮出“井”字，PBS 輕輕洗滌后換上新鮮的培養(yǎng)液，用腺病毒液(HBAD-m-Gap43-3xflag-GFP)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，感染24h后，進(jìn)行LPS處理72h。去上層培養(yǎng)液，PBS洗滌2次,-20℃冰甲醇固定15 min，PBS洗3 次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗3次。含DAPI染色封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察，所用圖片均在40倍鏡下拍攝。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《SPSS 20.0》統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

GAP-43在腎小球疾病患者腎組織的足細(xì)胞中表達(dá)降低免疫熒光染色后，通過腎小球足細(xì)胞標(biāo)記蛋白Synaptopodin來定位足細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示正常腎組織腎小球足細(xì)胞表達(dá)GAP-43蛋白，而在MCD 、FSGS 、MN患者的腎小球足細(xì)胞內(nèi)GAP-43的表達(dá)明顯降低(圖1) 。

圖1 GAP-43在腎小球疾病患者腎組織的足細(xì)胞中表達(dá)減少M(fèi)CD:微小病變腎病;FSGS:局灶節(jié)段性腎小球硬化;MN:膜性腎病;GAP-43:生長相關(guān)蛋白43;人類腎組織免疫熒光染色：綠色為GAP-43，紅色為Synaptopodin(激光共聚焦顯微鏡，×400)

LPS刺激下足細(xì)胞GAP-43表達(dá)減少LPS體外刺激足細(xì)胞0h、24h、48h、72h后，通過足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Synaptopodin定位足細(xì)胞，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，免疫熒光結(jié)果顯示，與正常對照組比較，LPS組GAP-43表達(dá)明顯降低(圖2)。同樣RT-PCR及Western印跡檢測也發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞GAP-43表達(dá)，與正常對照組相比，LPS組足細(xì)胞GAP-43蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)(圖3)。

圖2 LPS體外處理后，足細(xì)胞GAP-43表達(dá)降低control：正常對照組;LPS:脂多糖；GAP-43：生長相關(guān)蛋白43；體外足細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果：藍(lán)色為DAPI，綠色為GAP-43，紅色為Synaptopodin，黃色為Merge 后共定位的足細(xì)胞(激光共聚焦，×40)

過表達(dá)足細(xì)胞中GAP-43效率的驗(yàn)證過表達(dá)水平與對照組的相比明顯升高(P<0.05)，本實(shí)驗(yàn)可明確GAP-43過表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備(圖4)。

過表達(dá)GAP-43后，LPS刺激所致的足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin低表達(dá)有所恢復(fù)nephrin是足細(xì)胞裂孔膜上的一種跨膜蛋白，在維持足細(xì)胞足突的完整性及裂孔膜的正常功能有著重要作用。與正常組相比，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞在LPS刺激72h后，特異性膜蛋白nephrin表達(dá)明顯降低；與vector組比較，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞用腺病毒感染過表達(dá)GAP-43后,LPS刺激72h，特異性膜蛋白nephrin低表達(dá)有所恢復(fù)(圖5a、5b)。

圖3 LPS處理后，足細(xì)胞GAP-43表達(dá)減少LPS:脂多糖;GAP-43:生長相關(guān)因子43;a、b：LPS干預(yù)足細(xì)胞不同時(shí)間對GAP-43表達(dá)的影響(a：實(shí)時(shí)定量PCR，b：Western 印跡及定量分析)；與0h相比，*：P<0.05，n=3

圖4 GAP-43過表達(dá)效率驗(yàn)證vector:病毒對照組；GAP-43:生長相關(guān)蛋白43；與對照組比，#：P>0.05,*：P<0.05,n=3

圖5 過表達(dá)GAP-43對足細(xì)胞的保護(hù)作用GAP-43:生長相關(guān)蛋白43；LPS:脂多糖；CaN：鈣調(diào)磷酸酶；NFATc1:T細(xì)胞核因子1;control:對照組；a:過表達(dá)GAP-43驗(yàn)證Western印跡及定量分析;b:過表達(dá)GAP-43對nephrin影響，Western印跡及定量分析;c、d:過表達(dá)GAP-43對CaN及NFATc1影響Western 印跡及定量分析;#：與control組相比，P<0.05，n=3;*：與vector+LPS組比較，P<0.05，n=3

過表達(dá)GAP-43后，LPS刺激增加的CaN表達(dá)和核NFATc1表達(dá)降低與正常組相比，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞在LPS刺激72h后，Western印跡顯示CaN蛋白及細(xì)胞核內(nèi)NFATc1表達(dá)明顯增加；與vector組比較，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞用腺病毒感染過表達(dá)GAP-43后,LPS刺激72h，升高的CaN蛋白及細(xì)胞核內(nèi)NFATc1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)(圖5c、5d)。

過表達(dá)GAP-43足細(xì)胞的活動性降低足細(xì)胞活動性的變化與足細(xì)胞損傷有著直接的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察足細(xì)胞在不同條件下的活動性變化，通過計(jì)數(shù)足細(xì)胞偏離劃痕邊緣的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與正常組相比，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞在LPS刺激72h后，可看足細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多，足細(xì)胞活動性增高(P<0.05)；與vector組比較，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞用腺病毒感染過表達(dá)GAP-43后,LPS刺激72h，足細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少，足細(xì)胞活動性降低(P<0.05)(圖6)。

圖6 GAP-43對足細(xì)胞活動性影響a～d:足細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(藍(lán)色為DAPI)；Control組相比，LPS刺激后，足細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多，足細(xì)胞活動性增高，#：P<0.05，n=30;與vector+LPS組比較，過表達(dá)GAP-43后，足細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少，足細(xì)胞活動性降低，*：P<0.05，n=30(熒光顯微鏡，×40)

討 論

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，幾乎參與了所有腎小球疾病的病理改變，也是臨床治療的重要靶點(diǎn)[14]GAP-43在第二信使信號通路中參與信號傳遞的過程[8]。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，GAP-43基因正常表達(dá)，在既往神經(jīng)系統(tǒng)研究中，一系列應(yīng)激刺激下(缺血、缺氧) 可導(dǎo)致?lián)p傷部位周圍正常組織表達(dá)上升[15-16]。GAP-43是鈣激活蛋白家庭的一員,可調(diào)節(jié)Ca2+流量及鈣調(diào)素的效力[9]。GAP與鈣調(diào)素結(jié)合及被PKC磷酸化的區(qū)域?yàn)楣餐Y(jié)合域(GAP-43第39～51位氨基酸構(gòu)成的一個(gè)結(jié)構(gòu)域)[9-10]，同時(shí)GAP-43是通過磷酸化及去磷酸化來發(fā)揮作用。在足細(xì)胞中，GAP-43 的表達(dá)和效應(yīng)尚未有報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在人類腎組織的腎小球足細(xì)胞及體外培養(yǎng)的分化成熟足細(xì)胞中均有GAP-43的表達(dá)，且在人類慢性腎臟病MCD、FSGS、MN患者腎小球足細(xì)胞中表達(dá)降低，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞在LPS損傷刺激下表達(dá)也下降。提示GAP-43可能與足細(xì)胞損傷有關(guān)，研究表明當(dāng)足細(xì)胞受損時(shí)，足細(xì)胞標(biāo)記蛋白nephrin表達(dá)下降。為進(jìn)一步探究GAP-43在足細(xì)胞中的效應(yīng)，過表達(dá)GAP-43后，LPS刺激下，降低的足細(xì)胞標(biāo)記蛋白nephrin表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明對于足細(xì)胞而言GAP-43是一個(gè)保護(hù)因子。

GAP-43是鈣激活蛋白家庭的一員，GAP與鈣調(diào)蛋白結(jié)合及被PKC磷酸化的區(qū)域?yàn)橄嗤瑓^(qū)域。即當(dāng)Ca2+低水平時(shí)，GAP-43與鈣調(diào)蛋白(CaM)緊密結(jié)合，在第二信使作用下Ca2+大量涌入細(xì)胞，GAP-43 被磷酸化， GAP-43 便釋放CaM[10]。CaM 的釋放，引起神經(jīng)末端局部位點(diǎn)CaM 依賴的級聯(lián)蛋白CaN激活。國內(nèi)外研究者[5-7]報(bào)道，CaN-NFAT 信號軸活化參與足細(xì)胞損傷、凋亡和腎小球硬化。在絕大多數(shù)腎小球疾病，CaN 抑制劑(如環(huán)孢素A)都有顯著降低尿蛋白和保護(hù)足細(xì)胞的作用，反映了經(jīng)典通路CaN-NFAT在腎小球疾病發(fā)病機(jī)制中的至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS損傷刺激下，足細(xì)胞GAP-43表達(dá)降低。猜想其對足細(xì)胞的損傷保護(hù)機(jī)制是否與核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1有關(guān)? 國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)NFATc1是足細(xì)胞損傷的重要因子[17-19]，轉(zhuǎn)錄因子NFAT 分子家族有五個(gè)亞型，分別為NFAT1、NFATC1、NFAT3、NFAT4、NFAT5，除NFAT5外其他成員都受Ca2+-CaN信號通路調(diào)節(jié)[20]，當(dāng)細(xì)胞受到刺激引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增加時(shí)，CaN活化，催化核轉(zhuǎn)錄因子NFAT 去磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、生長[20]，過表達(dá)足細(xì)胞GAP-43表達(dá)后，LPS刺激導(dǎo)致的足細(xì)胞CaN活化抑制，核NFATc1 蛋白表達(dá)減少。這些結(jié)果表明GAP-43可能是通過抑制經(jīng)典CaN-NFAT通路，減少NFATc1 的入核來保護(hù)足細(xì)胞。

本研究首次發(fā)現(xiàn)GAP-43在足細(xì)胞中有表達(dá)，且是一個(gè)足細(xì)胞保護(hù)因子，可能是通過CaN-NFAT信號軸介導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)損傷機(jī)制。本研究豐富了CaN-NFAT 信號軸機(jī)制，可能為臨床治療慢性腎小球疾病提供新的干預(yù)可能。除本研究發(fā)現(xiàn)的GAP-43-CaN-NFATc1信號軸以外，可能還存在其他信號通路調(diào)控足細(xì)胞損傷。后續(xù)我們將繼續(xù)探究相關(guān)問題，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證GAP-43對CaN和NFATc1信號軸的關(guān)系及對腎臟損害的影響，從而為GAP-43應(yīng)用于臨床提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。