黃荷鳳 徐晨明 劉雪麗 施煒慧 葉木槿

全球首例植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)試管嬰兒誕生已近30年，作為產(chǎn)前診斷的替代治療方法，PGT的發(fā)展可謂一日千里，對(duì)PGT結(jié)果正常的胎兒進(jìn)行移植已造福許多家庭。PGT主要分為植入前遺傳學(xué)非整倍體檢測(cè)(PGT for aneuploidies，PGT-A)、染色體結(jié)構(gòu)重排檢測(cè)(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和單基因病檢測(cè)(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)。現(xiàn)就近年來(lái)PGT在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。

1 活組織檢查(簡(jiǎn)稱活檢)技術(shù)的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

胚胎活檢是PGT過(guò)程中獲取遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，其對(duì)胚胎本身發(fā)育潛能和出生子代健康的影響一直備受關(guān)注。采取何種活檢方式、在何種時(shí)期進(jìn)行活檢仍存在爭(zhēng)議。根據(jù)取材時(shí)間可分為卵母細(xì)胞的極體活檢(polar body biopsy，PBB)、卵裂期胚胎的卵裂球活檢(blastomere biopsy，BB)和囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢(trophectoderm biopsy，TB)。PBB對(duì)胚胎損傷很小，倫理上更易被接受，第一極體和第二極體序貫活檢可預(yù)測(cè)母源染色體整倍性和與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)。由于只能檢測(cè)母方的遺傳信息，PBB進(jìn)行非整倍體篩查時(shí)可錯(cuò)漏高達(dá)40%的染色體異常[1]。由于無(wú)需等待胚胎發(fā)育到囊胚期，BB曾被廣泛應(yīng)用，但其弊端在于對(duì)胚胎的損傷大、可供檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量少、準(zhǔn)確度低、嵌合比例高，且卵裂期的胚胎普遍存在染色體不穩(wěn)定(chromosome instability，CIN)現(xiàn)象。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院一項(xiàng)多中心大規(guī)模隊(duì)列研究[2]結(jié)果顯示，卵裂期胚胎凍融造成的卵裂球丟失會(huì)引起胚胎植入率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率均降低。此外，已有研究[1]發(fā)現(xiàn)，相同的胚胎在卵裂期與囊胚期的活檢結(jié)果存在差異，可能的解釋為技術(shù)失誤或胚胎發(fā)育伴隨著自我修復(fù)。若胚胎自我修復(fù)為胚胎早期發(fā)育的常見(jiàn)現(xiàn)象，在其進(jìn)行自我糾正之前進(jìn)行活檢可能會(huì)導(dǎo)致胚胎浪費(fèi)。2000年初掀起了第一代基于熒光原位雜交(FISH)和BB的PGT-A或植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)的熱潮，直到著名的“Mastenbroek爭(zhēng)論”表明其不會(huì)升高反而降低高齡女性的妊娠率，才一度推翻了PGS的有效性。其無(wú)效性的解釋包括指征過(guò)泛、FISH只能檢測(cè)5～7條染色體、卵裂期胚胎高度嵌合、技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)不足等。在引入染色體全面篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)和TB后，PGS 2.0重新進(jìn)入了大眾的視野。目前TB已逐漸取代了BB，活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎損傷小，并且可一次檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞，其診斷結(jié)果更可靠，然而嵌合體胚胎的問(wèn)題隨之而來(lái)。有研究結(jié)果顯示，TB樣本含有20%～40%的嵌合比例，其大多數(shù)胚胎具有整倍體內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)。盡管TB檢出的相對(duì)嵌合比例更低，但目前尚未確定滋養(yǎng)層細(xì)胞的核型反映ICM核型的程度。值得注意的是，一些非侵入性的檢測(cè)技術(shù)為胚胎檢測(cè)開(kāi)辟了新方向。Magli等[3]發(fā)現(xiàn)，囊胚液里的DNA高度碎片化，推測(cè)為非整倍體細(xì)胞的凋亡產(chǎn)物，佐證了早期胚胎存在自我修復(fù)和對(duì)異常細(xì)胞的清除過(guò)程，故研究者認(rèn)為可根據(jù)囊胚液擴(kuò)增的結(jié)果評(píng)估胚胎質(zhì)量。綜上所述，胚胎活檢對(duì)于胎兒的潛在傷害有待進(jìn)一步研究，需要根據(jù)疾病的類型(染色體病或基因病)、疾病發(fā)生的分子機(jī)制(減數(shù)分裂或有絲分裂)選擇最佳活檢方式，與此同時(shí)，非侵入性檢測(cè)技術(shù)是未來(lái)PGT發(fā)展的重要趨勢(shì)。

2 檢測(cè)和分析技術(shù)的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

繼PGS 1.0后，PGT-A檢測(cè)已被新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)和微陣列比較基因組雜交(array CGH，aCGH)技術(shù)所取代。NGS被廣泛應(yīng)用于針對(duì)染色體倒位、平衡易位、非平衡易位或羅伯遜易位等患者的PGT-SR中。另外，NGS能更好地檢出微小拷貝數(shù)變異和嵌合體，以Illumina VeriSeq PGS為代表的高分辨NGS(high-resolution NGS，hr-NGS)對(duì)嵌合體的檢出比aCGH更為敏感、準(zhǔn)確，可檢出嵌合比例為20%～80%的胚胎，但存在背景噪聲與低比例嵌合難以區(qū)分的問(wèn)題。不同遺傳實(shí)驗(yàn)室在TB的嵌合體評(píng)價(jià)上無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，過(guò)于嚴(yán)苛的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可能使得有發(fā)育潛能的嵌合體胚胎歸類為異常胚胎，導(dǎo)致胚胎浪費(fèi)，反之則導(dǎo)致異常嵌合胚胎被移植而引起不良生殖結(jié)局。

等位基因脫扣(allele dropout，ADO)、等位基因優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增、擴(kuò)增失敗和DNA污染等是影響PGT-M準(zhǔn)確診斷的重要因素。ADO指2個(gè)等位基因中的1個(gè)無(wú)法通過(guò)PCR擴(kuò)增。當(dāng)對(duì)致病基因(特別是復(fù)合雜合致病的基因)直接測(cè)序時(shí)，高頻率ADO的發(fā)生將嚴(yán)重影響診斷結(jié)果。尤其在PGT-M過(guò)程中，由于活檢細(xì)胞數(shù)量有限、DNA濃度低，全基因組擴(kuò)增(whole genetic amplification，WGA)大大增加了ADO發(fā)生的可能。盡管目前基于多重置換擴(kuò)增反應(yīng)(multiple displacement amplification，MDA)的WGA具有較高的保真性和擴(kuò)增效率，但ADO的發(fā)生仍不可避免。因此，建立能夠發(fā)現(xiàn)潛在ADO的檢測(cè)方法是避免PGT-M誤診的重要手段。

目前臨床上主要通過(guò)同時(shí)檢測(cè)致病基因及其兩側(cè)連鎖的多態(tài)性標(biāo)記，如SNP或短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)位點(diǎn)，即植入前遺傳學(xué)單倍型分析(preimplantation genetic haplotyping,PGH)技術(shù)間接檢測(cè)胚胎是否攜帶致病突變，以降低高比率ADO造成誤診的可能。其中檢測(cè)涉及的STR或SNP位點(diǎn)往往需要針對(duì)不同的單基因疾病、不同的家庭單獨(dú)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)，檢測(cè)成本較高、耗時(shí)長(zhǎng)。雖然新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展降低了尋找SNP位點(diǎn)的難度和成本，但需要經(jīng)驗(yàn)豐富的人員進(jìn)行人工篩選提供信息的SNP位點(diǎn)(informative SNP)。且目前采用的策略是靶向捕獲測(cè)序，而非基于全基因組的SNP單體型分析，可檢測(cè)的單基因遺傳病數(shù)量仍然受限。

近年來(lái)發(fā)展的Karyomapping技術(shù)是一種基于連鎖分析技術(shù)、針對(duì)廣泛的單基因遺傳病的胚胎植入前檢測(cè)方法。與直接突變檢測(cè)和靶向單倍型分析相比，Karyomapping技術(shù)操作簡(jiǎn)單，并在保持檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)具有較好的靈活性，即無(wú)需對(duì)特定的患者和疾病設(shè)計(jì)相應(yīng)的檢測(cè)方案[4]。此外，Karyomapping檢測(cè)所得的SNP位點(diǎn)覆蓋整個(gè)基因組，可同時(shí)進(jìn)行染色體變異檢測(cè)，包括非整倍體和染色體大片段缺失等。然而無(wú)先證者、新發(fā)突變、生殖系嵌合或缺乏關(guān)鍵患病家族成員等情況發(fā)生時(shí)，將影響單倍型的構(gòu)建，此時(shí)若進(jìn)行PGT-M，則需在明確致病變異的前提下，通過(guò)精子單倍型檢測(cè)或(和)PBB獲取親代的單體型信息。當(dāng)夫妻雙方為近親結(jié)婚時(shí)，致病基因兩側(cè)的遺傳學(xué)標(biāo)記同源性高，將影響特異性DNA標(biāo)記的篩選，從而限制了PGH技術(shù)的應(yīng)用。

明確致病基因和基因變異的致病性是PGT-M開(kāi)展的前提，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的普及，更多的基因變異位點(diǎn)被檢出，變異位點(diǎn)的致病性分析成為PGT-M檢測(cè)前遺傳咨詢的重要內(nèi)容。由于缺乏必要的證據(jù)支持，依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)變異分類指南[5]，一些未被疾病數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的罕見(jiàn)類型變異將被分類為臨床意義未明(VUS)變異，而這些變異往往需通過(guò)基因功能學(xué)實(shí)驗(yàn)或等待數(shù)據(jù)庫(kù)更新、文獻(xiàn)支持證據(jù)出現(xiàn)，才可能被重新歸類為致病性或良性變異，成為或排除進(jìn)行PGT的依據(jù)，而數(shù)據(jù)更新所需的漫長(zhǎng)等待周期和不確定因素是目前攜帶VUS變異患者的最大困境。

3 移植胚胎的選擇

嵌合體胚胎包含兩種及以上核型的細(xì)胞，多源于胚胎發(fā)育早期減數(shù)分裂或有絲分裂錯(cuò)誤，屬于PGT-A除整倍體和非整倍體胚胎的第三類檢測(cè)結(jié)果。有基于動(dòng)物和人類研究結(jié)果證明，通過(guò)異常細(xì)胞凋亡、正常細(xì)胞傾向分布于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和有絲分裂時(shí)染色體異常的糾錯(cuò)機(jī)制等，嵌合體胚胎在植入前的發(fā)育會(huì)自我修復(fù)和選擇。移植嵌合體胚胎后的活產(chǎn)報(bào)道[6]顯示了嵌合體胚胎的發(fā)育潛能，由此人們開(kāi)始重新思考嵌合體胚胎的臨床管理策略。盡管如此，許多證據(jù)表明，與整倍體胚胎相比，嵌合體胚胎的植入率更低、流產(chǎn)率更高。胚胎在2細(xì)胞期就可出現(xiàn)嵌合，發(fā)展到卵裂期和囊胚期的胚胎嵌合比例分別為15%～90%和15%～30%[7]。胚胎嵌合的發(fā)生與女方年齡并不相關(guān)，其發(fā)生機(jī)制及其可能帶來(lái)的影響尚不明確。因此，對(duì)于高齡、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或反復(fù)著床失敗者進(jìn)行的PGT-A檢測(cè)，移植胚胎應(yīng)優(yōu)先選擇正常的整倍體胚胎，若無(wú)其他可用胚胎，移植嵌合體胚胎前需告知咨詢者存在潛在的流產(chǎn)或胎兒異常的風(fēng)險(xiǎn)。

盡管人們已廣泛認(rèn)識(shí)到卵裂期和囊胚期的胚胎嵌合現(xiàn)象，但是由于倫理、法律限制和研究材料的稀缺，有關(guān)嵌合體的研究主要局限于描述層面，缺乏功能上的驗(yàn)證，因此確定嵌合體的發(fā)病率、實(shí)際比例，以及量化嵌合胚胎的活力和發(fā)育潛能仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。原則上，當(dāng)無(wú)整倍體胚胎可用時(shí)，在遺傳咨詢時(shí)進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)告知并獲得患者的知情同意后才可考慮嵌合體胚胎移植。國(guó)際胚胎植入前遺傳學(xué)診斷協(xié)會(huì)(PGDIS)和孕前、胚胎移植前和產(chǎn)前基因診斷辯論協(xié)會(huì)(CoGEN)指南建議，采用hr-NGS平臺(tái)對(duì)囊胚5～10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，異常細(xì)胞>70%的胚胎不可移植，同時(shí)應(yīng)避免移植可活產(chǎn)的13、18、21、22嵌合三體，與單親二倍體有關(guān)的14、15嵌合三體，以及與宮內(nèi)發(fā)育遲緩相關(guān)的2、7、16嵌合三體胚胎。

4 倫理的沖突與碰撞

以往的產(chǎn)前診斷并不針對(duì)遲發(fā)型遺傳性疾病進(jìn)行診斷，如成年型多囊腎病、Huntington舞蹈病等。隨著PGT相關(guān)技術(shù)的迅猛發(fā)展和人們健康意識(shí)的提高，其適應(yīng)證已由最初的染色體疾病和單基因疾病擴(kuò)展到遲發(fā)型遺傳病和人類白細(xì)胞抗原(HLA)配型(PGT for human leukocyte antigen，PGT-HLA)，前者主要包括癌癥易感性疾病(如乳腺癌、卵巢癌等)、心臟疾病和神經(jīng)退行性疾病等。隨著臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，PGT不可避免地引發(fā)越來(lái)越多的倫理爭(zhēng)議。雖然對(duì)于這類非早期發(fā)病或非100%發(fā)病的疾病開(kāi)展PGT仍有爭(zhēng)議，但越來(lái)越多的患者將在胚胎早期排除致病變異的PGT檢測(cè)技術(shù)視為優(yōu)先選擇。因此，遺傳咨詢過(guò)程中，必須充分告知這類疾病的臨床表型、疾病轉(zhuǎn)歸、易感風(fēng)險(xiǎn)、早期預(yù)防、PGT選擇等方面的信息。此外，一些血液系統(tǒng)疾病或免疫缺陷疾病，如地中海貧血、高IgM綜合征等，在進(jìn)行常規(guī)PGT-M檢測(cè)的同時(shí)可進(jìn)行HLA配型，為前胎患兒提供干細(xì)胞移植供體，但常因獲得PGT-M檢測(cè)正常的胚胎少而使得獲得HLA匹配的胚胎概率較低(常染色體隱性遺傳病理論上得到HLA配型的胚胎概率為3/16，常染色體顯性疾病為1/8)。若這類患者為高齡生育，需于遺傳咨詢時(shí)告知其存在較高的胚胎非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)。此外，如何對(duì)待不符合要求的胚胎和“救星胎兒”是否被“物化”等倫理問(wèn)題都是值得探討的。另外，全外顯子測(cè)序前未告知次要發(fā)現(xiàn)(secondary findings)會(huì)觸發(fā)一些倫理問(wèn)題，ACMG推薦可報(bào)告59個(gè)可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病如腫瘤、心血管疾病，以及可實(shí)施醫(yī)療干預(yù)的疾病基因變異。胎兒性別作為實(shí)施PGT過(guò)程中的常規(guī)次要發(fā)現(xiàn)，美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)(ASRM)表示應(yīng)告知患者這種可能性，但醫(yī)師不可將胎兒性別作為生殖決策的影響因素。

5 結(jié) 語(yǔ)

PGT是人類生殖健康發(fā)展的一項(xiàng)革命性進(jìn)展，通過(guò)高通量技術(shù)獲得胚胎的基因組信息，選擇最合適的胚胎移植入母體內(nèi)，極大地提高了廣大遺傳病家庭生育健康子代的可能性，也為治療特定遺傳病同胞患者提供了新的途徑。PGT的飛速發(fā)展必然會(huì)帶來(lái)新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，醫(yī)師必須在“生殖自由、切勿傷害”的原則下作出生殖決策，這是PGT造福人類的基石。