馬榮輝，董春嵐，韓有溪，曹國(guó)磊，羅琴

(新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830000)

原發(fā)性肺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居全球惡性腫瘤首位，其中80%～85%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。研究[1]顯示，超過半數(shù)的NSCLC患者初次診斷時(shí)即處于晚期。肺腺癌是最常見的NSCLC的組織學(xué)亞型，占50%以上[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因是NSCLC中發(fā)生發(fā)展過程中最重要的驅(qū)動(dòng)基因之一。以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)對(duì)EGFR基因突變型NSCLC療效顯著，已被作為此類患者的一線治療藥物[4]。雖然吉非替尼的臨床反應(yīng)良好，但許多患者在治療10～14個(gè)月時(shí)都會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗[5]。目前針對(duì)吉非替尼耐藥的NSCLC的新型靶向治療藥價(jià)格較貴，患者往往經(jīng)濟(jì)無法負(fù)擔(dān)或精神壓力較大而造成治療受阻，因此選用合適的輔助藥物提高吉非替尼對(duì)EGFR基因突變型NSCLC的敏感性、延緩耐藥、延長(zhǎng)治療時(shí)間值得深入研究。華蟾素是我國(guó)自行研發(fā)的一種中藥抗腫瘤藥物，在腫瘤的協(xié)同放化療及靶向治療中被廣泛應(yīng)用[6]。研究[7～9]顯示，華蟾素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并且已經(jīng)引入到臨床治療中。本研究觀察了不同濃度華蟾素聯(lián)合吉非替尼對(duì)人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 華蟾素、細(xì)胞及試劑 華蟾素購(gòu)自solarbio公司，人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株A549由新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤研究所提供，吉非替尼購(gòu)自國(guó)藥公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司，流式細(xì)胞儀CytoFLEX購(gòu)自BECKMAN公司，胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，DMEM購(gòu)自GIBCO公司，兔多抗GAPDH(AB-P-R001)抗體購(gòu)自杭州賢至生物有限公司，兔多抗met(156KD)抗體購(gòu)自Bioworld公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將A549細(xì)胞置于pH 7.2～7.4的含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，分為吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組和對(duì)照組。吉非替尼組分別加入1、5、10、20、40 μmol/L的吉非替尼，記為A1、A2、A3、A4、A5組；華蟾素組分別加入0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL的華蟾素，記為B1、B2、B3、B4、B5組；聯(lián)合藥物組分別加入1 μmol/L吉非替尼+0.005 mg/mL華蟾素、5 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL華蟾素、10 μmol/L吉非替尼+0.05 mg/mL華蟾素、20 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL華蟾素、40 μmol/L吉非替尼+0.5 mg/mL華蟾素，記為C1、C2、C3、C4、C5組；對(duì)照組加入等量DMSO。

1.3 各組細(xì)胞增殖能力觀察 取A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接入96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，按照“1.2”方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，加入10 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min，以空白孔為空白組，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在568 nm處的吸光度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 A5、B5、C5和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取A549細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板，按照“1.2”方法進(jìn)行分組處理，選取A5、B5、C5和對(duì)照組細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞，PBS潤(rùn)洗2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC、5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 A5、B5、C5和對(duì)照組細(xì)胞c-met蛋白檢測(cè) 采用Western Blotting法。取A549細(xì)胞，加入3 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS洗去培養(yǎng)液，加入400 μL含PMSF(100 mmol/L)的裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min提取細(xì)胞總蛋白，BSA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度定量。取細(xì)胞總蛋白40 μg，加入緩沖液于沸水中煮沸10 min使蛋白變性，用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和Maker加入上樣孔進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡，室溫?fù)u床封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌PVDF膜5～6次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影，使用BandScan分析蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 ①A1、A2、A3、A4、A5組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)的OD值分別為0.410±0.030、0.371±0.037、0.322±0.010、0.284±0.025、0.196±0.020，B1、B2、B3、B4、B5組分別為0.463±0.021、0.454±0.017、0.472±0.013、0.460±0.009、0.452±0.028,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.412±0.016、0.359±0.023、0.306±0.035、0.249±0.020、0.174±0.024，對(duì)照組為0.458±0.025；其中，吉非替尼組、聯(lián)合藥物組與對(duì)照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；C2、C3、C4、C5組與相同濃度的A2、A3、A4、A5組和B2、B3、B4、B5組相比，P均<0.05。②A1、A2、A3、A4、A5組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)的OD值分別為0.541±0.010、0.453±0.016、0.396±0.011、0.344±0.014、0.261±0.011,B1、B2、B3、B4、B5組分別為0.688±0.035、0.687±0.018、0.677±0.018、0.641±0.036、0.556±0.019,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.526±0.033、0.431±0.019、0.376±0.027、0.296±0.022、0.209±0.027,對(duì)照組為0.684±0.019；其中，吉非替尼組、B3組、B4組、B5組、聯(lián)合藥物組與對(duì)照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；聯(lián)合藥物組與相同濃度的吉非替尼組、華蟾素組相比，P均<0.05。③A1、A2、A3、A4、A5組細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)的OD值分別為0.755±0.021、0.590±0.024、0.499±0.023、0.353±0.022、0.267±0.005,B1、B2、B3、B4、B5組分別為1.088±0.176、0.990±0.085、0.849±0.038、0.758±0.050、0.704±0.041,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.714±0.033、0.481±0.036、0.383±0.026、0.310±0.006、0.232±0.011,對(duì)照組為1.089±0.190；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組與對(duì)照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；聯(lián)合藥物組與相同濃度的吉非替尼組、華蟾素組相比，P均<0.05。各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，相同濃度組間相比，P均<0.05。

2.2 A5、B5、C5、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較 A5、B5、C5、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)的凋亡率分別為14.37%±0.48%、9.76%±0.37%、35.01%±0.62%、4.13%±0.65%，組間相比，P均<0.01。

2.3 A5、B5、C5、對(duì)照組細(xì)胞c-met蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A5、B5、C5、對(duì)照組細(xì)胞中c-met蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.477±0.034、0.629±0.007、0.332±0.010、0.738±0.023，組間相比，P均<0.001。

3 討論

目前所發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤中，肺癌患病及致死率均居第一，由于肺癌早期缺乏典型臨床癥狀，很難做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)展期的肺癌5年生存率不足15%[10]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，2015年我國(guó)肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)分別為73萬例和61萬例。在治療肺癌期間，中草藥的輔助治療在減輕患者臨床癥狀、改善生活質(zhì)量及延長(zhǎng)生存期方面有明顯優(yōu)勢(shì)，并越來越多的在相關(guān)領(lǐng)域受到關(guān)注[12]。華蟾素主要成分為蟾素內(nèi)酯，具有很強(qiáng)的抗癌活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷和抑制作用?，F(xiàn)已報(bào)道，華蟾素在肝癌[13]、前列腺癌[14]、胃癌[15]等多種癌癥中可發(fā)揮抗腫瘤效果。熊飛等[16]發(fā)現(xiàn)，華蟾素可顯著抑制裸鼠的肺癌A549移植瘤生長(zhǎng)，與抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)其凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素單獨(dú)作用于肺癌A549細(xì)胞后有明顯的增殖抑制效果，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；在聯(lián)合吉非替尼后，增值率也明顯低于吉非替尼組，說明華蟾素對(duì)肺癌A549細(xì)胞是有增殖抑制作用的，且在聯(lián)合吉非替尼時(shí)也起到一定的增效作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，華蟾素可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的凋亡，在聯(lián)合用藥后，細(xì)胞凋亡率明顯高于任一單獨(dú)用藥組，說明華蟾素能顯著提高肺癌A549細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，同時(shí)增強(qiáng)了吉非替尼的抗腫瘤活性，從而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。

EGFR是一種廣泛表達(dá)的酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，其在表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的下游信號(hào)通路的過度表達(dá)和異常激活與各種上皮源性腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[17]。經(jīng)典的EGFR信號(hào)通路主要依賴于其酪氨酸激酶活性，在EGF等配體的指導(dǎo)下，EGFR通過自身的二聚或與其他家族成員的相互作用而被激活。激活的EGFR通過激活Ras-Raf-MEK-ERK1/2、PI3-K-Akt-mTOR、JAK2-STAT3和PLC-γ-PKC-IKK等途徑參與一系列腫瘤細(xì)胞惡性表型的調(diào)節(jié)[18]。EGFR擴(kuò)增和異常激活是NSCLC常見的分子事件，因此，在NSCLC的臨床治療中應(yīng)用了以EGFR為靶點(diǎn)的受體酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼和厄洛替尼[19]。EGFR-TKIs已上市近10年，對(duì)EGFR突變的NSCLC患者具有良好的臨床療效，但頻繁的耐藥限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[20]。EGFR-TKIs如吉非替尼的耐藥主要由于異常突變激活下游的表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路Ras-Raf-MEK-ERK1/2 PI3-K-Akt-mTOR,或由于繼發(fā)性耐藥如c-met過表達(dá)等二級(jí)EGFR基因突變,使得EGFR靶向治療受到極大地限制[21]。c-met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的受體。研究[22]表明，c-met的高表達(dá)可以激活腫瘤細(xì)胞中多種信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的生存和生長(zhǎng)。c-met通路是誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥的重要機(jī)制，因此，輔助靶向治療降低c-met過表達(dá)已成為提高抗腫瘤藥物療效的重要策略[23]。有研究[24]顯示，華蟾素可以抑制HGF/c-met通路蛋白的表達(dá)，抑制荷瘤小鼠肝癌的生長(zhǎng)。本研究表明，在c-met蛋白表達(dá)上，華蟾素單藥及聯(lián)合用藥均可使其蛋白表達(dá)降低，其中聯(lián)合用藥組與吉非替尼組存在顯著差異。

綜上所述，與單獨(dú)應(yīng)用吉非替尼或華蟾素相比，華蟾素聯(lián)合吉非替尼可抑制人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株A549等增殖，促進(jìn)其凋亡；華蟾素聯(lián)合吉非替尼可通過下調(diào)c-met蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，因華蟾素能幫助吉非替尼降低對(duì)c-met的表達(dá)，我們推測(cè)華蟾素可在一定程度上延緩肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥的發(fā)生。這些研究為吉非替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療增效及尋求延長(zhǎng)耐藥的方法提供了新的策略和思路。