陳嶸，鄭斯明，蘇年華，左可軍

(1 中山市人民醫(yī)院，廣東中山528403；2 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

鼻咽癌細(xì)胞常發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮，發(fā)病部位解剖結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，為頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其癌細(xì)胞病理分化程度低并且比較容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。鼻咽癌高發(fā)于北非及東南亞，我國(guó)華南地區(qū)的發(fā)病率也較高，該病的致病因素至今未完全明了，可能與環(huán)境因素、遺傳因素和EB病毒感染相關(guān)[2]。目前，鼻咽癌的主要治療手段為放射治療，但是大多數(shù)初診患者已經(jīng)發(fā)生局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其療效欠佳，患者治療后可能會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[3]。因此，探尋一種療效顯著、不良反應(yīng)小的治療方案迫在眉睫。維替泊芬是一種光學(xué)增強(qiáng)劑，美國(guó)FDA于2000年批準(zhǔn)其應(yīng)用于以脈絡(luò)膜血管形成為主的老年黃斑相關(guān)疾病的臨床治療。近期多項(xiàng)研究[4]表明，維替泊芬具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，具有良好的抗腫瘤效應(yīng)。研究[5]表明，維替泊芬可特異性抑制癌蛋白YAP1，并影響腫瘤細(xì)胞中眾多基因及信號(hào)通路的調(diào)控，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因及蛋白生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。目前無(wú)維替泊芬對(duì)鼻咽癌細(xì)胞作用的相關(guān)研究報(bào)道。2018年10月～2019年4月，本研究觀察了不同濃度的維替泊芬對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE1增殖、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 CNE1細(xì)胞在含100 mg/L鏈霉素、100 mL/L血清和100 kU/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至密度達(dá)80%左右時(shí)，胰酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE1細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入1、2、4 μmol/L的維替泊芬，記為A、B、C組，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。

1.2 各組細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。取各組細(xì)胞以6×103/孔接種于96孔板，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，加入CCK8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，以空白孔為空白組，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞增殖能力。

1.3 各組細(xì)胞克隆形成能力觀察 采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d，去除6孔板中的培養(yǎng)基并用DPBS緩沖液沖洗干凈，4%多聚甲醛固定30 min后沖洗干凈，結(jié)晶紫溶液染色30 min，去除染色液后充分清洗干凈，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)(超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)細(xì)胞克隆)。以細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)表示細(xì)胞克隆形成能力。

1.4 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。Transwell小室經(jīng)培養(yǎng)基濕潤(rùn)后包被Matrigel膠，于培養(yǎng)箱中放置30 min備用。取各組細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基并接種于上室，終體積為200 μL；下室中加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，藥物濃度與上室一致。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，甲醇固定30 min，DPBS清洗2遍，加入結(jié)晶紫染色1 h，去除染色液后用棉簽擦去殘膠，DPBS洗滌3遍后干燥，100倍光鏡下隨機(jī)選擇中央及四周5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并用PBS清洗3次，充分去除洗滌液后加入100 μL Binding buffer重懸，加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：畫十字門，記錄各組十字門的第四象限細(xì)胞百分比。以第四象限細(xì)胞百分比表示各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 各組細(xì)胞周期觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并用PBS清洗3次，充分去除洗滌液后加入75%乙醇固定，4 ℃存放24 h，PBS洗滌3次后加入500 μL PI重懸，4 ℃避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 B組及對(duì)照組細(xì)胞中YAP1、TEAD、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、髓細(xì)胞組織增生蛋白(MYC)、Axl mRNA及蛋白檢測(cè) ①采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA。取B組及對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，TRIzol裂解并提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：YAP1上游引物為5′-GCCCAGTTATACCTCAGTGTTGTAG-3′，下游引物為5′-GGTCTCCTTCAGGTCAGTACAG-3′；TEAD上游引物為5′-GCCCATGTGCGAGTACCT-3′，下游引物為5′-TCCAGGACGCTGTTCATCA-3′；Caspase-3上游引物為5′-GGCTGAGCTGCCTGTAACTTG-3′，下游引物為5′-TGGCTCTGCCTTCATGGAAC-3′；Bcl-2上游引物為5′-GAGCACAGAAGATGGGAACACT-3′，下游引物為5′-AGGTGCATGGATTTACTCAGTATC-3′；Cyclin D1上游引物為5′-CTGGGTCTGTGCATTTCTGGTT-3′，下游引物為5′-CTGCTGGAAACATGCCGGTTA-3′；MYC上游引物為5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′，下游引物為5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；Axl上游引物為5′-CCACCTTTCGGGCCATGTT-3′，下游引物為5′-GAGGCACCAGAGTCCACACT-3′；GAPDH上游引物為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游引物為5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。建立20 μL qRT-PCR擴(kuò)增體系，包含TB Green混合物10 μL，DEPC水6.4 μL，cDNA 2 μL和相關(guān)基因上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt表示細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對(duì)表達(dá)量。②采用Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白。取B組及對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，充分洗滌后用細(xì)胞裂解液4 ℃條件下充分裂解20 min，提取全細(xì)胞蛋白并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠，每個(gè)電泳通道加入30 μg蛋白，80 V恒壓電泳0.5 h后，120 V電泳1 h，250 mA恒流濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶溶液中封閉1.5 h，分別將PVDF膜孵育相應(yīng)一抗溶液，4 ℃搖床搖晃過(guò)夜，TBST溶液洗滌3次(10 min/次)，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST溶液漂洗二抗3次(10 min/次)，瀝干后加入ECL發(fā)光液，于Tannon成像系統(tǒng)中顯影，蛋白灰度值采用Image J軟件計(jì)算。以目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 A、B、C及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞存活率分別為85.27%±0.63%、74.18%±1.01%、57.67%±0.92%、100.00%±0.42%，組間相比，P均<0.05；A、B、C及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞存活率分別為70.35%±0.61%、59.33%±1.27%、41.39%±0.46%、100.00%±0.85%，組間相比，P均<0.05；A、B、C組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h時(shí)的細(xì)胞存活率，與24 h時(shí)相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞克隆形成能力比較 A、B、C及對(duì)照組細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)分別為183.67±12.92、118.67±10.50、47.33±5.31、253.67±8.18個(gè)，組間相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 A、B、C及對(duì)照組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為44.67±2.87、28.67±4.11、16.67±3.68、56.67±5.31個(gè)，組間相比，P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 A、B、C及對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為14.52%±1.03%、26.56%±2.10%、38.64%±1.42%、5.31%±0.77%，組間相比，P均<0.05。

2.5 各組細(xì)胞周期比較 A組G2/M、S、G0/G1期細(xì)胞分別為15.46%±1.74%、42.37%±2.69%、42.17%±1.73%，B組G2/M、S、G0/G1期細(xì)胞分別為8.39%±0.77%、34.48%±0.57%、57.13%±0.39%，C組G2/M、S、G0/G1期細(xì)胞分別為3.82%±1.89%、26.16%±0.81%、70.02%±1.42%，對(duì)照組G2/M、S、G0/G1期細(xì)胞分別為21.52%±0.75%、53.14%±1.31%、25.34%±0.95%，各細(xì)胞周期比例組間相比，P均<0.05。

2.6 B組及對(duì)照組細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 ①B組細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.12、0.56±0.17、0.35±0.25、0.43±0.29、0.48±0.27、0.39±0.35、0.35±0.71，對(duì)照組細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.33、1.00±0.67、1.00±0.14、1.00±0.28、1.00±0.81、1.00±0.33、1.00±0.11，兩組相比，P均<0.05。②B組細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.45、0.44±0.31、0.42±0.23、0.61±0.09、0.39±0.41、0.52±0.38、0.48±0.21，對(duì)照組細(xì)胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.56、1.00±0.82、1.00±0.73、1.00±0.32、1.00±0.34、1.00±0.14、1.00±0.29，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

鼻咽癌是人類常見(jiàn)惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，目前治療手段有限。近年來(lái)，惡性腫瘤的分子靶向精準(zhǔn)治療取得了較大進(jìn)步。多項(xiàng)研究[6]表明，Hippo通路參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。Hippo通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞生存，從而影響組織及器官發(fā)育。Hippo通路中核心轉(zhuǎn)錄共刺激因子YAP1可通過(guò)磷酸化及去磷酸化調(diào)節(jié)并參與細(xì)胞中一系列的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[7]。多項(xiàng)研究[8]表明，YAP1在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并且調(diào)節(jié)著癌細(xì)胞增殖、生存及侵襲能力。Song等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者的鼻咽組織中YAP1表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康供者，提示癌蛋白YAP1是鼻咽癌潛在的治療新靶點(diǎn)，為靶向精準(zhǔn)治療藥物開發(fā)拓展新方向。本研究結(jié)果顯示，加入不同濃度的維替泊芬后，鼻咽癌細(xì)胞株CNE1的增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力顯著下降，細(xì)胞凋亡率升高，阻滯其生長(zhǎng)周期，且維替泊芬對(duì)CNE1細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用存在一定的濃度依賴性。

Brodowska等[9]發(fā)現(xiàn)，YAP可以與TEAD形成TEAD-YAP復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)下游原癌基因c-myc、Axl以及細(xì)胞遷移和血管生成因子等表達(dá)，維替泊芬可抑制YAP-TEAD復(fù)合物的形成并阻斷下游因子的表達(dá)，從而殺傷視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞。研究[10]顯示，YAP可通過(guò)TEAD直接激活Pik3cb表達(dá)并誘導(dǎo)PI3K轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而活化PI3K/AKT通路，YAP通過(guò)AKT途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力。進(jìn)一步研究[11]發(fā)現(xiàn)，AKT抑制劑可抑制YAP1的活性并減弱結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的翻譯活性，激活肝癌細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡并抑制腫瘤細(xì)胞的生存能力。Wei等[12]發(fā)現(xiàn)，YAP1抑制劑維替泊芬可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，其抗胰腺癌活性與腫瘤細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)升高相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中多種蛋白水解酶對(duì)靜息狀態(tài)的caspase-3酶原進(jìn)行水解，激活caspase-3剪切酶，加強(qiáng)維替泊芬殺傷腫瘤細(xì)胞能力。研究[13]顯示，YAP1抑制劑維替泊芬可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞及胰腺癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，其機(jī)制與抗凋亡蛋白Bcl-2、MYC、caspase-3、Cyclin D1表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果同樣表明，維替泊芬可通過(guò)激活及裂解caspase-3并抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，維替泊芬抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期進(jìn)展，將CNE1細(xì)胞阻滯于G0/G1期，減少S期及G2/M期比例，阻滯細(xì)胞增殖。前期研究[14]發(fā)現(xiàn)，維替泊芬作用于白血病細(xì)胞后可抑制YAP和TEAD蛋白的相互作用，促進(jìn)YAP和TEAD蛋白的降解，并且抑制CyclinD1蛋白的翻譯活動(dòng)，將白血病細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，降低S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)，抑制白血病細(xì)胞增殖率。本研究發(fā)現(xiàn)，維替泊芬可減弱鼻咽癌細(xì)胞中的YAP和TEAD蛋白復(fù)合體的相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解。同時(shí)減少細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)量，抑制鼻咽癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，降低鼻咽癌細(xì)胞中DNA合成量，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生存及增殖能力。

綜上所述，1、2、4 μmol/L的維替泊芬均可抑制CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯生長(zhǎng)周期，且調(diào)節(jié)作用與維替泊芬的濃度有關(guān)；維替泊芬調(diào)控CNE1細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的作用機(jī)制可能與抑制YAP1及其下游因子的表達(dá)有關(guān)。本研究一定程度上為鼻咽癌在分子靶向精準(zhǔn)治療方面提供了理論支撐，為鼻咽癌患者的治療提供了新選擇及新希望。