張寶臻，余澗坤

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽(yáng)110004；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

基因治療是將基因轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中，通過(guò)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，使相應(yīng)疾病狀態(tài)得以減輕或糾正，最終達(dá)到治療疾病的目的。病毒類(lèi)基因載體可以將外源基因?qū)爰?xì)胞并高效表達(dá)目的基因，是目前臨床治療采用的主要載體。但是該類(lèi)載體具有較高的免疫原性，病毒組件激活還會(huì)導(dǎo)致病毒相關(guān)疾病的發(fā)生，而且基因組容量也有限。因此，基于臨床多次給藥的特點(diǎn)及用藥安全性的要求，非病毒類(lèi)基因載體更適合作為基因治療的運(yùn)載工具。陽(yáng)離子聚合物基因載體是近年來(lái)非病毒類(lèi)基因載體領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),常見(jiàn)的陽(yáng)離子聚合物基因載體有聚乙烯亞胺(PEI)、聚氨基胺(PAAs)、聚氨基酯(PAEs)和天然生物相容性高分子材料等。本文綜述了這幾類(lèi)載體的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)修飾等優(yōu)化策略，總結(jié)此類(lèi)載體在現(xiàn)階段研究中存在的問(wèn)題，為基因載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建提供新的思路。

1 PEI基因載體

1.1 PEI基因載體的物理化學(xué)性質(zhì) PEI單體(-CH2-CH2-NH-)中每3個(gè)原子含有1個(gè)氮原子，構(gòu)成具有伯胺、仲胺、叔胺基團(tuán)的水溶性聚合物。這些胺基的pKa值不同，使PEI在較寬的pH范圍內(nèi)具有吸收質(zhì)子的能力(即“質(zhì)子海綿”作用)。PEI吸收H+使整個(gè)聚合物變成核正電，使得PEI具有較強(qiáng)結(jié)合核負(fù)電DNA和黏附細(xì)胞的能力；同時(shí)PEI吸收H+使內(nèi)涵體滲透壓增高，導(dǎo)致內(nèi)涵體膜不穩(wěn)定甚至破裂，有效幫助目的基因片段實(shí)現(xiàn)“內(nèi)涵體逃逸”，避免目的基因在溶酶體內(nèi)降解，才能攜帶目的基因片段進(jìn)入細(xì)胞核。因此PEI有較高的轉(zhuǎn)染效率[1]，常作為基因載體研究的陽(yáng)性對(duì)照組。

PEI包載外源基因形成復(fù)合物的最佳分子量為5～25 kDa。高分子量PEI較低分子量PEI的轉(zhuǎn)染效率更高，但高分子量PEI往往有較高的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，相近分子量的支化PEI的目的基因片段包載能力、轉(zhuǎn)染效率均優(yōu)于線形PEI，因此支化PEI更適宜作為非病毒類(lèi)基因載體進(jìn)行應(yīng)用，而且PEI中伯胺基團(tuán)越多則形成的基因載體復(fù)合物越穩(wěn)定。

1.2 PEI基因載體的結(jié)構(gòu)修飾 對(duì)PEI載體的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在優(yōu)先對(duì)該類(lèi)載體的末端伯胺基的修飾。研究表明，聚合物伯胺和仲胺的乙?；揎?，能夠通過(guò)降低聚合物的胞質(zhì)緩沖能力和穩(wěn)定性，進(jìn)而增加目的基因片段在胞質(zhì)中的釋放；聚合物中仲胺和叔胺基團(tuán)的數(shù)目越多，載體對(duì)外源基因的包封率越大，從而可能產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率。Thomas等[2]研究發(fā)現(xiàn)，用丙氨酸或十二烷基對(duì)聚合物的末端伯胺基團(tuán)進(jìn)行修飾，能得到高效低毒的聚合物基因載體。通過(guò)對(duì)聚合物載體進(jìn)行交聯(lián)或側(cè)鏈修飾來(lái)引入可生物降解的具有生物響應(yīng)性的化學(xué)鍵，會(huì)影響載體在體內(nèi)的降解、消除，進(jìn)而影響目的基因的釋放和載體的細(xì)胞毒效應(yīng)。例如:引入二硫鍵、亞胺鍵、酯鍵將低分子量的PEI連接起來(lái)，形成線形或分枝狀結(jié)構(gòu)的高分子量PEI，由于這種衍生物具有較多的可生物降解的化學(xué)鍵，使其在體內(nèi)可降解成低毒或無(wú)毒的低分子量PEI，這樣在具有較高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，兼顧了較低的細(xì)胞毒性。

1.3 PEI基因載體的靶向修飾 采用生物活性基團(tuán)特異性配體直接修飾PEI主鏈，制備具有特異性靶向功能的PEI軛合物載體。除了低分子量PEI自身偶聯(lián)外，另一種對(duì)PEI載體進(jìn)行修飾的方法是通過(guò)引入特異性配體，通過(guò)配體間特異性的疏水作用實(shí)現(xiàn)聚合物各組件之間的物理吸引，從而改變其空間結(jié)構(gòu)以獲得高效低毒的新載體，例如PEG-生物素/生物素抗體-PEI、PEI-環(huán)糊精/棕櫚酸酯-胰島素等。Liu等[3]將低分子量PEI和肌醇(INO)交聯(lián)，并與半乳糖接枝的PEG接合形成共聚物L(fēng)A-PegPI，該載體顯示出了優(yōu)異的體循環(huán)穩(wěn)定性和較低的細(xì)胞毒性，在去唾液酸糖蛋白受體陽(yáng)性的肝細(xì)胞中具有高轉(zhuǎn)染效率。低分子量PEI與β-環(huán)糊精和丙烷-1,2,3-三醇交聯(lián)形成共聚物后，此共聚物在B16-F0細(xì)胞中使裸DNA的轉(zhuǎn)染效率提高了700倍。除了B16-F0細(xì)胞，該聚合物還能在HepG2和U87細(xì)胞實(shí)現(xiàn)目的基因片段的高效遞送，轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞毒性較低[4]。因此，引入共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)修飾，尤其是引入特異性配體等生物功能性基團(tuán)的共價(jià)修飾在現(xiàn)階段研究中仍占主導(dǎo)地位。

2 PAAs基因載體

2.1 PAAs基因載體的物理化學(xué)性質(zhì) 溶解度是PAAs基因載體的重要性質(zhì)，多數(shù)載體能夠溶于水、有機(jī)溶劑，如氯仿、低級(jí)醇類(lèi)及其他極性有機(jī)溶劑。PAAs在水中和有機(jī)溶劑中有一定的固有黏度，其在溶液中和同分子量的乙烯類(lèi)聚合物相比有更大的流體體積，溶液中聚合物鏈的伸展程度更大。PAAs載體的降解速率受氨基和酰胺鍵數(shù)目以及空間結(jié)構(gòu)的影響。鑒于此類(lèi)聚合物存在上述降解特性，在進(jìn)行加成聚合的過(guò)程中應(yīng)注意：在聚合反應(yīng)完成之前，水性介質(zhì)的存在會(huì)使聚合物的分子量增加，聚合反應(yīng)完成時(shí)分子量達(dá)到最大，之后水性介質(zhì)的存在會(huì)使聚合物分子量下降，即加成聚合反應(yīng)和酰胺鍵的水解反應(yīng)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

2.2 PAAs基因載體的結(jié)構(gòu)修飾 線形PAAs包括多種具有交替酰胺基團(tuán)和叔胺基團(tuán)的聚合物，可通過(guò)伯胺基團(tuán)的兩個(gè)活性反應(yīng)位點(diǎn)或兩個(gè)仲胺基團(tuán)的活性位點(diǎn)與雙丙烯酰胺衍生物通過(guò)加成聚合反應(yīng)制得。主鏈中的叔胺基團(tuán)可以質(zhì)子化，進(jìn)而賦予PAAs堿性和聚合物表面的核正電及良好的水溶性。Lin等[5]合成并研究了含有不同比例仲胺和叔胺基團(tuán)的PAAs，并進(jìn)一步將這些氨基單體同含有二硫鍵的交聯(lián)劑進(jìn)行加成聚合，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)S2-PAAs具有更高的轉(zhuǎn)染效率及更低的細(xì)胞毒性。Jones等[6]研究了多種線形PAAs的電荷密度、剛性對(duì)其與外源目的基因片段結(jié)合能力、結(jié)合后的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率等性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，電荷密度、結(jié)構(gòu)柔韌性是通過(guò)影響聚合物與核酸的結(jié)合能力及復(fù)合物膠體穩(wěn)定性，來(lái)進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)染效率。

在PAAs載體中引入含有二硫鍵的交聯(lián)劑引起了基因載體研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，因?yàn)槎蜴I可被細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的還原酶類(lèi)降解而發(fā)生斷裂，但是在胞外非還原環(huán)境中卻可以穩(wěn)定存在。Lin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，含二硫鍵的支化PAAs載體比25 kDa的PEI載體轉(zhuǎn)染效率更高。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈基團(tuán)的引入及其緩沖能力的提高能夠顯著提高轉(zhuǎn)染效率；側(cè)鏈仲胺基團(tuán)的引入和氨基間隔距離的縮小，均能夠提高轉(zhuǎn)染效率并降低細(xì)胞毒性。Li等[8]認(rèn)為，研究S2-PAAs主鏈中二硫鍵的多少只對(duì)基因/載體復(fù)合物的解聚敏感性有影響，并不是轉(zhuǎn)染效率升高的主要因素。此外，Piest等[9]在PAAs載體中引入硼酸片段，發(fā)現(xiàn)雖然硼酸片段的引入降低了復(fù)合物粒徑，轉(zhuǎn)染效率有一定程度的提高，但同時(shí)也增大了細(xì)胞毒性。

2.3 PAAs基因載體的靶向修飾 對(duì)于PAAs基因載體的靶向修飾，目前的策略之一是對(duì)PEG化的聚合物中PEG鏈末端接上特異性配體，而這種配體能夠通過(guò)加強(qiáng)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，進(jìn)而增加基因/載體復(fù)合物的入胞量，甚至利用配體進(jìn)行特異性的細(xì)胞或組織靶向傳遞。Wood等[10]研究的半乳糖修飾的PEG-PAAs樹(shù)枝狀聚合物，在人肝細(xì)胞HepG2的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了相當(dāng)高的轉(zhuǎn)染效率。

Yu等[11]設(shè)計(jì)并構(gòu)建了具有多個(gè)含有二硫鍵的胍基化聚氨基胺(Gua-SS-PAAs)，與PEI相比表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性。引入Gua-SS-PAAs聚合物中的胍和羧基能導(dǎo)致更好的核定位效應(yīng)，對(duì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率、降低細(xì)胞毒性起關(guān)鍵作用。Yu等[12]制備了還原敏感性及酸不穩(wěn)定性的雙功能PAAs，將其用于靶向腫瘤細(xì)胞、組織的基因傳遞，獲得了一定的腫瘤組織靶向性和較好的轉(zhuǎn)染效率。

3 PAEs基因載體

3.1 PAEs基因載體的物理化學(xué)性質(zhì) PAEs基因載體由于酯鍵容易水解，具有易降解的特性，因此細(xì)胞毒性較低。線性PAEs能溶于二氯甲烷、甲醇等有機(jī)溶劑，同時(shí)還能夠溶于酸性水溶液中。研究發(fā)現(xiàn)，線性PAEs在pH值為5的環(huán)境中降解較慢，而處于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下幾乎不發(fā)生降解。與含有叔胺的線性PAEs相比，支鏈PAEs作為基因載體應(yīng)用存在著諸多優(yōu)勢(shì)：支鏈PAEs水溶性更好；支鏈PAEs中伯胺更多，質(zhì)子化作用更強(qiáng)，包載效率更高，因此能形成粒徑更小的包裹目的基因片段的納米顆粒。此外，由于伯胺和仲胺基團(tuán)的存在，支鏈PAEs有更大的pH緩沖能力。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，支鏈PAEs分子量就越大。支鏈PAEs在生理?xiàng)l件下的降解速度要快于酸性條件下的降解速度，親水性高的支鏈PAEs降解速度更快[13]。同PEI基因載體一樣，PAEs也具有質(zhì)子海綿效應(yīng)。

3.2 PAEs基因載體的結(jié)構(gòu)修飾 研究發(fā)現(xiàn)，PAEs化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異能夠?qū)е翽AEs和DNA之間親合力的不同。聚合物和目的基因片段之間的親合力提高，有助于增強(qiáng)復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而提高細(xì)胞攝取率。但是，聚合物跟目的基因片段之間的結(jié)合力如果太強(qiáng)，目的基因片段不易從基因載體復(fù)合物中釋放出來(lái)，反而降低轉(zhuǎn)染效率。研究表明，當(dāng)聚合物的鏈長(zhǎng)超過(guò)一定范圍之后，載體的轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降，即同種載體隨著分子量的增加，存在一個(gè)最佳的轉(zhuǎn)染效率。Sunshire等[14]研究了PAEs疏水性和末端修飾基團(tuán)對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果顯示，如果PAEs合成過(guò)程中丙烯酸酯過(guò)量，最后以酯基封端，其轉(zhuǎn)染效率會(huì)遠(yuǎn)小于以胺基封端的PAEs；進(jìn)一步研究顯示，如果采用親水的胺基(如羥基胺)封端，PAEs具有較高的轉(zhuǎn)染效率，如果采用疏水的胺基(如烷基胺、芳基胺)封端，PAEs的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。

3.3 PAEs基因載體的靶向修飾 PAEs的靶向修飾包括被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向修飾兩方面。被動(dòng)靶向效應(yīng)主要受兩個(gè)因素影響，即載體表面電荷和基因載體復(fù)合物粒徑。對(duì)于非特異靶向性細(xì)胞攝取，復(fù)合物表面正電荷密度越大，與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷作用越強(qiáng)烈，從而越容易被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)[15]。復(fù)合物粒徑越小，細(xì)胞攝取效率越高，100 nm左右的復(fù)合物細(xì)胞攝取效率達(dá)到最佳狀態(tài)。但是，當(dāng)載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染時(shí)，粒徑大的基因/載體復(fù)合物可以更好地在培養(yǎng)基中沉淀，有助于提高體外轉(zhuǎn)染效率；而對(duì)于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程而言，較大的復(fù)合物粒徑更容易被巨噬細(xì)胞吞噬，無(wú)法到達(dá)作用靶點(diǎn)。因此，粒徑對(duì)載體被動(dòng)靶向的影響是多方面的，要結(jié)合表面電荷和粒徑等因素綜合考慮。

相對(duì)于被動(dòng)靶向修飾，主動(dòng)靶向的修飾策略更加多樣化、具體化。Zugates等[16]以2-(硫代吡啶)乙胺為單體胺合成聚氨基酯，這樣聚氨基酯側(cè)鏈中的硫代吡啶就可以與巰基化的RGD蛋白等配體結(jié)合，使其具有靶向性。但是隨著配體取代率的提高，轉(zhuǎn)染效率反而下降，主要原因與配體的引入改變了聚合物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。隨后Green等[17]放棄共價(jià)修飾的方法，轉(zhuǎn)而將荷負(fù)電的蛋白質(zhì)配體通過(guò)靜電結(jié)合方式覆蓋在載體表面，形成粒徑100～200 nm的電中性基因載體復(fù)合物。結(jié)果表明，電中性的復(fù)合物在循環(huán)系統(tǒng)中與血漿組分的相互作用降低，穩(wěn)定性提高，體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率也較非特異性PAEs載體顯著提高。

4 天然生物相容性高分子載體材料

4.1 殼聚糖 殼聚糖作為一種天然陽(yáng)離子聚合物，通過(guò)與帶負(fù)電的核酸分子以靜電吸引方式相互作用，使殼聚糖-核酸體系形成包載復(fù)合物降低機(jī)體內(nèi)環(huán)境中的各種因素對(duì)目的基因片段的降解，最終進(jìn)入細(xì)胞。殼聚糖具有細(xì)胞毒性低、可生物降解、免疫原性低等特性，體現(xiàn)了良好的生物相容性，且具有抗菌、抗氧化活性及黏附特性等特點(diǎn)。但是殼聚糖的溶解性和靶向性較差，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染率較低。

Liu等[18]將PEI通過(guò)酰胺化反應(yīng)接枝到羧甲基殼聚糖的主鏈上，這種結(jié)構(gòu)修飾提高了羧甲基殼聚糖與目的基因片段結(jié)合形成納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物的效力,使其具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性。Peng等[19]采用甘露糖修飾的殼聚糖包載促胃液素釋放肽基因質(zhì)粒制備得到的納米顆粒傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)顯示出較高的轉(zhuǎn)染效率，顯著提高了目的基因到達(dá)巨噬細(xì)胞細(xì)胞核的數(shù)量。

4.2 葡聚糖 葡聚糖是由多個(gè)重復(fù)葡萄糖單元構(gòu)成的多糖聚合物，具有良好的生物相容性，是一類(lèi)良好的載體材料。葡聚糖具有很多易于化學(xué)修飾的羥基結(jié)構(gòu)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和基因治療的研究。Tang等[20]開(kāi)發(fā)了葡聚糖-肽雜交系統(tǒng)作為基因治療的載體，該載體能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的目的基因表達(dá)和更低的細(xì)胞毒性。

4.3 環(huán)糊精 環(huán)糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常由6～8個(gè)葡萄糖單元通過(guò)α-1,4-糖苷鍵相接，對(duì)目的基因有很好的保護(hù)作用，且可以攜帶目的基因順利跨過(guò)細(xì)胞膜。環(huán)糊精無(wú)免疫原性，生物相容性好，但很少獨(dú)立作為基因載體材料使用，用PEI修飾環(huán)糊精可顯著提高轉(zhuǎn)染效率[21]。

5 總結(jié)與展望

選擇安全、高效的基因載體是基因治療最為關(guān)鍵的一步。盡管相當(dāng)多的載體材料都能實(shí)現(xiàn)基因的有效遞送，然而現(xiàn)有材料遞送目的基因的轉(zhuǎn)染效率很難超過(guò)PEI，也遠(yuǎn)未達(dá)到病毒載體的水平。低分子量和低電荷密度的陽(yáng)離子聚合物一般細(xì)胞毒性也較低，但轉(zhuǎn)染效率也會(huì)降低。對(duì)于陽(yáng)離子聚合物基因載體的改造，可以對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，主要策略集中在對(duì)伯胺、仲胺、叔胺基的修飾；另一方面可以對(duì)其進(jìn)行靶向修飾，例如采用生物活性基團(tuán)特異性配體來(lái)修飾基因載體。基因載體的仿生與智能設(shè)計(jì)也是未來(lái)增強(qiáng)基因治療效果的有效策略之一，比如可以根據(jù)腫瘤組織的不同微環(huán)境，如低氧狀態(tài)、低pH、高濃度的蛋白酶和氧化還原條件來(lái)設(shè)計(jì)和構(gòu)建智能載體的尺寸和性質(zhì)。此外，讓載體同時(shí)遞送兩種或多種治療基因的組合方法可以增強(qiáng)癌癥等多基因相關(guān)疾病的治療效果并降低體內(nèi)細(xì)胞毒性。