謝偉 唐眉 趙國(guó)芝 王鋼

非洲豬瘟疫苗研究新進(jìn)展

謝偉①唐眉①趙國(guó)芝①王鋼②*

（①四川省樂(lè)山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 614000 ②樂(lè)山師范學(xué)院 四川 樂(lè)山）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一種急性、熱性、出血性和高度接觸性傳染病，死亡率高達(dá)100%。給許多國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重打擊。該病由于基因組龐大且免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，至今尚無(wú)有效的預(yù)防疫苗和治療藥物。本文針對(duì)非洲豬瘟疫苗的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為該病疫苗的研發(fā)提供參考。

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，臨床癥狀以高熱、內(nèi)臟嚴(yán)重出血和高死亡率為特征。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。1921年，該病首次在肯尼亞報(bào)道[1]，并陸續(xù)在非洲大部分國(guó)家發(fā)生。20世紀(jì)60年代傳入歐洲，70年代傳入南美洲；2007年傳入格魯吉亞和俄羅斯聯(lián)邦和東歐地區(qū)，且呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)[2]；2017年3月在距離中國(guó)邊境僅1000公里的俄羅斯伊爾庫(kù)茨克暴發(fā)[3]。2018年8月該病在我國(guó)遼寧沈陽(yáng)首次確診，不到一年時(shí)間全國(guó)多個(gè)省份均有發(fā)生，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。

ASF病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是目前唯一已知的蟲(chóng)媒DNA病毒，具有雙層囊膜的二十面體結(jié)構(gòu)[4]。ASFV基因組全長(zhǎng)介于170-190kb之間，含有151-167個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，可編碼150-200個(gè)蛋白質(zhì)，其中結(jié)構(gòu)蛋白50多種。根據(jù)該病毒主要衣殼蛋白P72的編碼基因，可將其分為22個(gè)基因型，由于其表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性，加之抗感染機(jī)制非常復(fù)雜，截至目前對(duì)于A(yíng)SF尚無(wú)有效的藥物和其他治療手段。因此，加快ASF疫苗的研發(fā)和制定有效的防控措施顯得迫在眉睫。目前，我國(guó)正在加大ASF疫苗研究力度。

1 滅活疫苗

通過(guò)物理或化學(xué)手段將病原滅活，使其喪失感染能力，但保留免疫原性的方法制備的疫苗稱(chēng)為滅活疫苗。自ASF發(fā)現(xiàn)之后，研究人員就開(kāi)始研制滅活疫苗。然而至今為止，采用多種方法制備的ASF滅活疫苗，雖然部分滅活疫苗可產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，但在臨床上均不能提供有效的免疫保護(hù)[5, 6]，即使是使用PolygenTM或Emulsigen等最先進(jìn)佐劑也不能產(chǎn)生有效的保護(hù)[7]，這可能是由于A(yíng)SFV免疫機(jī)制非常復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒和細(xì)胞外病毒顆粒表面蛋白差異較大，滅活疫苗不能刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體[8]。結(jié)果提示，按照現(xiàn)有的滅活疫苗研究技術(shù)，很難研發(fā)出有效的ASFV滅活疫苗。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指用人工致弱或自然篩選等方法制備的弱毒株經(jīng)培養(yǎng)后制備而成，它一種病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。根據(jù)弱毒疫苗毒株來(lái)源不同，可將ASFV弱毒疫苗分為天然致弱疫苗和人工致弱疫苗，其中人工致弱疫苗又分為傳代致弱疫苗和重組致弱疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 目前，ASFV天然弱毒疫苗毒株有NH/P68、OURT88/3和Lv17/WB/Rie1三種，其中NH/P68和OURT88/3屬于基因I型，Lv 17/WB/Rie1屬于基因II型[9]。Leitao等[10]研究表明，免疫ASFV NH/P68的家豬對(duì)高毒性ASFV/l60毒株的攻擊具有抵抗力，但是可導(dǎo)致25%~47%的免疫豬出現(xiàn)慢性感染。免疫ASFV OURT88/3后的家豬，可對(duì)OURT88/1、Benin97/1和genotype X毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)，但會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等諸多臨床癥狀[11, 12]。Gallardo等[9]將從野豬分離的Lv17/WB/Rie1株感染豬后只有非特異性臨床癥狀或者沒(méi)有臨床癥狀，且可產(chǎn)生保護(hù)作用。Barasona等[13]研究表明，Lv17/Wb/Rie1菌株進(jìn)行口服免疫，可產(chǎn)生針對(duì)毒性ASF病毒分離物攻毒的92%的保護(hù)性，且具有較好的安全性，標(biāo)志著在野豬中控制非洲豬瘟取得了巨大進(jìn)展。 ASFV天然弱毒疫苗雖然可以對(duì)同源和部分異源毒株產(chǎn)生保護(hù)，但免疫副反應(yīng)和散毒等生物安全風(fēng)險(xiǎn)是限制其應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

2.2 傳代致弱疫苗 ASFV可在Vero、COS-1等細(xì)胞內(nèi)傳代培養(yǎng)，使其致病力不斷下降。有學(xué)者證實(shí)通過(guò)傳代致弱的ASFV弱毒疫苗可以抵御強(qiáng)毒株的攻擊[14]，但在隨后的田間試驗(yàn)卻造成了嚴(yán)重后果，許多免疫豬出現(xiàn)了肺炎、流產(chǎn)、死亡等副反應(yīng)，且存活的生豬大部分?jǐn)y帶病毒[8, 15]。Krug等[16]將ASFV-G在Vero細(xì)胞中傳至110代時(shí)，其毒力完成喪失，將其免疫豬后并不能抵御ASFV-G的攻擊。Lacasta等[17]將E75強(qiáng)毒在CV1細(xì)胞上傳代致弱的毒株免疫豬后發(fā)現(xiàn)，傳代致弱毒株疫苗能抵御同源毒株E751的攻擊，但不能抵御異源毒株BA71的攻擊。研究表明，ASFV傳代致弱疫苗安全性和異源保護(hù)力較差，這也是需研究突破的重點(diǎn)。

2.3 重組致弱疫苗 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和ASFV基因功能的不斷探索，對(duì)ASFV的某些毒力基因(如TK、UK、NL、CD2v等)、多基因家族(如MGF360/505)、免疫逃逸相關(guān)基因(如A238L、DP148R、MGF等)等基因敲除后可降低病毒毒力或增加宿主的免疫應(yīng)答[18]。Abrams等[19]將DP71L和DP96R基因敲除構(gòu)建的OUR T88/3?DP2重組疫苗免疫豬后，對(duì)強(qiáng)毒株OUR T88/1攻擊有66%的保護(hù)，對(duì)親本毒株OUR T88/3攻擊則100%保護(hù)，且免疫動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重副反應(yīng)。Reis等[20]將構(gòu)建的MGF530和MGF360缺陷毒株Benin?MGF免疫豬后發(fā)現(xiàn)，能夠100%抵御Benin 97/1的攻擊，而sanchez-Cordon等[21]研究結(jié)果最高保護(hù)率為83%，提示免疫劑量、免疫方式等影響免疫保護(hù)效果。Monteagudo等[22]研究表明，CD2v基因缺失構(gòu)建的BA71? CD2毒株具有交叉保護(hù)作用，能夠?qū)A71提供100%保護(hù)，而且也可抵御基因II型Georgia2007/1株的攻。最近，西班牙學(xué)者以野毒株NH/P68為骨架，構(gòu)建了A238L、A224L、EP153R和A276R等4種蛋白缺失株；攻毒試驗(yàn)表明，缺失株和NH/P68疫苗均能夠抵御同源病毒L60的攻擊，但對(duì)于A(yíng)EM07異源病毒攻擊，NH/P68疫苗能夠完全抵御而缺失株僅有半數(shù)免疫了A224L能夠抵御[23]?？傊?，研究表明ASF重組致弱疫苗可提供完全的同源保護(hù)、完全或部分的交叉保護(hù)，在未來(lái)疫苗開(kāi)發(fā)中前景較大，但目前仍存在殘余毒力、病毒血癥等問(wèn)題。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又稱(chēng)DNA疫苗，是將含有編碼主要抗原的基因克隆入真核表達(dá)載體并導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。2011年，Argilaguent等[24]將ASFV的P30和P54基因與豬白細(xì)胞抗原II抗體單鏈可變區(qū)融合構(gòu)建的質(zhì)粒，雖然可使部分生豬獲得一定的免疫保護(hù)效果，但不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊。2012年，Argilaguent等[25]研究發(fā)現(xiàn)，ASFV血凝素蛋白基因與P30、P54基因融合構(gòu)建的質(zhì)粒，能成倍地提高實(shí)驗(yàn)豬免疫后的體液反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)，但不能抵御ASFV-E75的攻擊；但將泛素基因與上述DNA疫苗融合后，可增強(qiáng)誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，并能夠使部分實(shí)驗(yàn)豬獲得免疫保護(hù)，提示細(xì)胞免疫在A(yíng)SF預(yù)防中至關(guān)重要。Lacasta等[26]構(gòu)建的一個(gè)包含4000多個(gè)質(zhì)粒表達(dá)文庫(kù)對(duì)豬免疫后，可對(duì)E75菌株產(chǎn)生60%的保護(hù)率，且存活生豬無(wú)排毒現(xiàn)象，這能有效解決目前ASF疫苗生物安全問(wèn)題。目前，雖然關(guān)于A(yíng)SF核酸疫苗研究的還比較少，但隨著ASFV保護(hù)性抗原和表達(dá)載體的不斷研究，ASF核酸疫苗在將來(lái)一定有重大突破。

4 亞單位疫苗

ASF亞單位疫苗是指將ASFV保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，并將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽通過(guò)適合的抗原傳遞系統(tǒng)免疫動(dòng)物而誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。P30、P54和P72是ASFV感染過(guò)程中引起體液免疫應(yīng)答的3個(gè)重要抗原蛋白，其中P54和P72產(chǎn)生抗體可阻止病毒吸附，P30產(chǎn)生抗體可阻止病毒內(nèi)吞[27]。重組表達(dá)的P30或P54蛋白以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但不能提供有效的免疫保護(hù)[28]，同時(shí)免疫P30和P54兩種蛋白時(shí)可提供部分保護(hù)[28, 29]，然而同時(shí)免疫P30、P54和P72三種蛋白時(shí)卻不能提供免疫保護(hù)[30]。最新研究結(jié)果表明，將載體表達(dá)ASFV抗原首免和減毒活疫苗加強(qiáng)免疫結(jié)合起來(lái)，可以擴(kuò)大對(duì)ASFV對(duì)表位的識(shí)別Murgia等[31]，這為ASFV不同類(lèi)型疫苗聯(lián)用提供了理論依據(jù)。

5 病毒活載體疫苗

通過(guò)腺病毒、痘病毒等載體表達(dá)ASFV保護(hù)性抗原基因，免疫豬只后可產(chǎn)生更好的特異性抗體和CTL反應(yīng)。Lokhandwala等[32, 33]以腺病毒為載體表達(dá)的ASFV抗原基因，采用“雞尾酒”式免疫后獲得了較好的抗原特異性CTL應(yīng)答。Madrid等[34]以痘病毒為載體表達(dá)的ASFV抗原基因，采用加強(qiáng)免疫策后可誘導(dǎo)ASFV特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。Murgia等[31]以α病毒為載體，構(gòu)建的ASFV p30(rp-30)、p54(rp-54)或pha-72(rp-sha-p72)抗原載體，其中rp-30在Vero細(xì)胞中表達(dá)最高并且具有較好的免疫原性。目前，ASF病毒活載體疫苗研究仍屬于起步階段，其安全性、有效性仍需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

6 展望

隨著經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展，人員和貿(mào)易來(lái)往頻繁加劇，2018年以來(lái)中國(guó)、越南等國(guó)家相繼發(fā)生ASF疫情，疫情趨勢(shì)呈現(xiàn)全球流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大威脅[35]。2019年1月，中國(guó)啟動(dòng)非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗研發(fā)項(xiàng)目。目前雖然研制的ASFV疫苗還存在保護(hù)力不強(qiáng)、病毒血癥、殘余毒力等方方面面的問(wèn)題，但相信不久將來(lái)，隨著世界各國(guó)對(duì)非洲豬瘟疫苗研發(fā)的日益重視，有效的、安全的ASFV疫苗會(huì)被研發(fā)出來(lái)。

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（2019–05–17）

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