李美鶴，戴爾珣，孫麗，侯雪芹，張汝建

(1泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271000；2蘇北人民醫(yī)院；3西安交大揚(yáng)州科技園；4泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

過(guò)繼免疫療法是癌癥免疫療法中的一種，是指將自體或異體的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞前體在體外進(jìn)行活化、增殖，然后輸入患者體內(nèi)，使其發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。過(guò)繼免疫療法作用靶點(diǎn)位于人體正常免疫細(xì)胞，通過(guò)激活自身的免疫系統(tǒng)達(dá)到治療癌癥的目的。細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)是人體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有殺瘤作用的異質(zhì)細(xì)胞群，它對(duì)癌癥的治療屬于過(guò)繼免疫療法，是腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫療法中的首選方法，而且是免疫治療的主要方法之一。一定數(shù)量的CIK細(xì)胞不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而且能增強(qiáng)患者免疫功能，提高患者免疫力，這一發(fā)現(xiàn)給予了可能攻克腫瘤的新希望[2～6]。由于在細(xì)胞免疫治療過(guò)程中所需CIK細(xì)胞數(shù)量巨大，但迄今為止如何更高效擴(kuò)增CIK尚未統(tǒng)一。1640培養(yǎng)基是擴(kuò)增CIK細(xì)胞最常用的一種培養(yǎng)基，GT-T551培養(yǎng)基也可以作為CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)的一種較佳選擇，早期研究[7]發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基能顯著提高CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，但目前對(duì)其所培養(yǎng)細(xì)胞殺傷作用的研究尚缺乏，所以GT-T551培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK的優(yōu)化培養(yǎng)體系仍需進(jìn)一步探索。IL-2是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子，并能夠促進(jìn)B細(xì)胞活化增殖，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子。此外，IL-2還參與體內(nèi)的抗原-抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視，在免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中起重要作用。IL-2雖然能夠增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，但一定濃度范圍內(nèi)的IL-2并不能對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性產(chǎn)生明顯影響[8]。在臨床應(yīng)用中，不僅要對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行評(píng)估，還要對(duì)其殺傷效果做出評(píng)價(jià)。通過(guò)研究不同效靶比CIK對(duì)肝癌的殺傷情況，以期為今后CIK細(xì)胞在肝癌中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，這對(duì)腫瘤免疫治療的發(fā)展也有重要意義。本研究觀察了不同培養(yǎng)基內(nèi)CIK細(xì)胞的增殖能力及不同效靶比CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，旨在尋找一種穩(wěn)定、高效的培養(yǎng)方法及殺傷腫瘤細(xì)胞的最佳效靶比。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 CIK細(xì)胞(抽取5例健康志愿者肘靜脈外周血各20 mL，肝素抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后，吸取白膜層，獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，PBS液洗滌2次，肝癌7721細(xì)胞(為實(shí)驗(yàn)室冷凍保存，將液氮冷凍保存的7721細(xì)胞放入37 ℃水浴箱中快速搖晃解凍，離心機(jī)1 500 r/min，5 min離心后棄上清，用10 mL含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移至T25培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天全量換液1次。在培養(yǎng)過(guò)程中光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞，并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞貼壁融合面積達(dá)90%以上時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取P3代細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn))；10%胎牛血清(杭州四季青)，RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，GT-T551(TaKaRa公司)，細(xì)胞凍存液(Zenoaq公司)，重組人白細(xì)胞介素-2(IL-2，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)，干擾素-γ(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司)，抗CD3單克隆抗體(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)，CCK8檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo公司)；三用電子恒溫水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱及離心機(jī)、酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.2 不同培養(yǎng)基中CIK細(xì)胞的增殖能力觀察 抽取5例健康志愿者肘靜脈外周血各20 mL，肝素抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后，吸取白膜層，獲得單個(gè)核細(xì)胞，PBS液洗滌2次。調(diào)整初始細(xì)胞密度為1×106/mL，用含2%健康成人血漿的1640培養(yǎng)基和GT-T551培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，第0天加入干擾素-γ，終濃度1 000 IU/mL。24 h后加入抗CD3單克隆抗體50 ng/mL、IL-2 500 IU/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激。兩種培養(yǎng)基分別加入0、200、500 IU/mL的IL-2。在培養(yǎng)的第4天，向兩種培養(yǎng)基中加入0、200、500 IU/mL的IL-2，并繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2～3 d補(bǔ)液1次。在培養(yǎng)的第0、3、6、9、12、15、18天于光學(xué)顯微鏡下觀察CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞總數(shù)=n/4×稀釋倍數(shù)×104)，并繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算各組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)(CIK細(xì)胞擴(kuò)增前后的細(xì)胞總數(shù)，以后者除以前者)。

1.3 不同效靶比的CIK細(xì)胞對(duì)7721細(xì)胞殺傷效應(yīng)觀察 將7721細(xì)胞與第10天的CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，調(diào)整癌細(xì)胞終濃度為5×104/mL。根據(jù)所需效靶比調(diào)整CIK細(xì)胞終濃度分別為0.5×106、1×106、2×106、4×106/mL。CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，7721細(xì)胞為靶細(xì)胞，按照效靶比10∶1、20∶1、40∶1、80∶1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并設(shè)置靶細(xì)胞對(duì)照組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，各孔總體積均為200 μL。置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后每孔各加入20 μL的CCK8檢測(cè)用試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，可根據(jù)培養(yǎng)板孔內(nèi)培養(yǎng)液的顯色情況略微調(diào)整顯色時(shí)間，然后對(duì)培養(yǎng)板中的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)OD450值，并計(jì)算殺傷率，殺傷率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)基細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較

注：與1640培養(yǎng)基比較，*P<0.05。

2.2 不同效靶比CIK細(xì)胞殺傷率比較 效靶比為10∶1、20∶1、40∶1、80∶1時(shí)CIK的殺傷率分別為(7.0±2.0)%、(15.6±2.3)%、(36.4±5.4)%、(52.1±14.4)%，80∶1時(shí)的殺傷率與其他三者比較，P均<0.05。

3 討論

近年來(lái)，肝癌的發(fā)生率仍居高不下且致死率高，為世界三大腫瘤之一[9]。我國(guó)是一個(gè)肝炎大國(guó)，雖然隨著生活水平的不斷提升，肝炎的患病率略有下降，但仍處于較高水平，且酒精性肝病和脂肪性肝病的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[10]，這是導(dǎo)致肝癌高發(fā)生率的一個(gè)重要原因。由于肝癌早期癥狀并不明顯，發(fā)現(xiàn)后多為中晚期，其治療主要依靠手術(shù)和放化療，而手術(shù)多不能根治性切除腫瘤，常殘留微小病灶，放化療則易加重患者心理負(fù)擔(dān)和對(duì)患者機(jī)體的不良反應(yīng)，并且術(shù)后容易復(fù)發(fā)，因此治療難度加大[11]。對(duì)于不能手術(shù)的晚期肝癌患者來(lái)說(shuō)，尋找有效的治療方法更是迫在眉睫。

CIK細(xì)胞作用廣泛，目前已逐步適用于臨床并占有越來(lái)越重要的地位。據(jù)相關(guān)報(bào)道，CIK細(xì)胞可明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要是通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)人肝癌干細(xì)胞(HCSCs)的凋亡，從而發(fā)揮殺傷作用[12～14]。研究顯示，CIK細(xì)胞對(duì)于肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、白血病等多種惡性腫瘤都能起到一定的療效，且與樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)聯(lián)合作用時(shí)能力更強(qiáng)[15～17]。另外，CIK細(xì)胞免疫療法聯(lián)合化療效果顯著且能降低化療所帶來(lái)的不良反應(yīng)[18～21]。相較于CIK細(xì)胞在臨床上的廣泛應(yīng)用及治療的肯定，如何在體外穩(wěn)定的大量擴(kuò)增CIK尚未有明確定論，這是目前亟待解決的問(wèn)題之一，且能為CAR修飾的CIK細(xì)胞大量增殖治療肝癌提供可靠保障。本研究顯示，GT-T551培養(yǎng)基更有利于CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，且CIK細(xì)胞的增殖對(duì)IL-2的作用具有濃度依賴性，也就是說(shuō)IL-2濃度越大細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)及細(xì)胞數(shù)峰值也越大。由此可見(jiàn)，IL-2在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著不可或缺的作用，一定范圍內(nèi)劑量越大作用越明顯。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)12 d后，細(xì)胞數(shù)目基本達(dá)到最大值，并未繼續(xù)增殖甚至略有下降，分析原因可能與細(xì)胞數(shù)目加大，培養(yǎng)基消耗過(guò)快，在培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)受限有關(guān)。在CIK細(xì)胞與7721細(xì)胞株的共培養(yǎng)中，隨效靶比增加，殺傷率逐漸升高，在效靶比80∶1時(shí)CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)更明顯。這與國(guó)內(nèi)外[22,23]一些關(guān)于CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用呈劑量依賴性的報(bào)導(dǎo)相一致。

總之，采用GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)外周血源的CIK細(xì)胞，定期加入500 IU/mL的IL-2是一種更為優(yōu)越的培養(yǎng)方案；在抑瘤方面，可以選擇第10天的CIK，通過(guò)較高效靶比發(fā)揮高殺傷作用。