周金林，鄧述愷，張仕國(guó)

(1巴中市中心醫(yī)院，四川巴中 636000；2西南醫(yī)科大學(xué)附院第一醫(yī)院)

肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，起源于支氣管黏膜或腺體。全球肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升態(tài)勢(shì)，而在我國(guó)尤其明顯；目前，我國(guó)肺癌的發(fā)病率及病死率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和病死率居第一位，女性發(fā)病率居第二位(低于乳腺癌)，而病死率居第一位[1]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC大約占肺癌的85%，通過傳統(tǒng)的治療手段，肺癌患者的5年生存率也只有15%左右，使用新的化療藥物和重組人血管內(nèi)皮抑制素以及分子靶向藥物治療后，患者中位生存時(shí)間有一定延長(zhǎng)，不過晚期肺癌患者的生存率仍然沒有大幅度提高[2]。近年來，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和基因檢測(cè)技術(shù)得到了很大的發(fā)展，肺癌的免疫治療已逐漸成為肺癌治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)了PD1、PD-L1等免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑，臨床試驗(yàn)表明免疫治療可以使NSCLC的病死率得到一定程度的改善。新近研究[3]發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中CRT的表達(dá)較正常肺組織明顯升高，并且與肺癌的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫關(guān)系密切。BAP31在結(jié)直腸癌、宮頸癌及惡性黑色素瘤中明顯升高，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系，并且與CRT關(guān)系密切；二者均有可能成為NSCLC診斷和治療的新靶點(diǎn)，以及預(yù)測(cè)預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究通過免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織、正常肺組織、癌旁組織中CRT與BAP31的表達(dá)，分析其表達(dá)的差異性，探索NSCLC組織中CRT和BAP31的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期的關(guān)系，并且研究CRT與BAP31在NSCLC組織的表達(dá)水平有無相關(guān)性，為進(jìn)一步尋找新的NSCLC生物標(biāo)記物以及免疫檢測(cè)和治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1～12月西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的NSCLC患者60例(腫瘤組)，男42例，女18例；年齡35～76(57.3±9.6)歲，其中≥60歲25例，<60歲35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所選病例均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為NSCLC患者；②具備完整的臨床診斷和治療資料；③排除其他肺部疾病以及嚴(yán)重的心、肝、腎和代謝性疾病，取得待測(cè)標(biāo)本前均未進(jìn)行放療、化療、分子靶向治療及其他針對(duì)惡性腫瘤的治療。依據(jù)WHO肺癌的組織病理學(xué)分類方法，腺癌30例，鱗癌30例；依據(jù)2014年NSCLC美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南，其中將既往有吸煙史且吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))≥400支年者列為肺癌的高危人群，以此標(biāo)準(zhǔn)將吸煙指數(shù)≥400支年者的重度吸煙患者歸入吸煙者(28例)，將吸煙指數(shù)<400支年者的輕中度吸煙患者、不吸煙者以及被動(dòng)吸煙者歸入非吸煙者(32例)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2015年第八版肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期組39例，Ⅲ+Ⅳ期組21例。手術(shù)切取NSCLC組織60例份、癌旁組織(至少距腫瘤邊緣5 cm以上)30例份(癌旁組)。

1.2 組織中CRT、BAP31檢測(cè)方法 切取NSCLC組織、正常肺組織以及癌旁組織蠟塊，每個(gè)標(biāo)本切片3張，然后進(jìn)行烤片，其中2張用于免疫組化，一張用于HE染色。HE染色常規(guī)進(jìn)行，光鏡下觀察染色結(jié)果，然后與免疫組化結(jié)果做對(duì)照。免疫組化染色經(jīng)過脫蠟、脫苯后分別向每張切片滴加約50 μL的3%H2O2浸泡10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用PBS液沖洗兩次，隨后將切片浸入盛有檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的高溫容器中，微波爐加熱直至沸騰后停止加熱，然后自然冷卻至室溫后取出玻片，蒸餾水沖洗2次，每次2 min，PBS液沖洗3次，每次5 min，厚滴加一抗：每張切片滴加正常山羊血清工作液進(jìn)行封閉，室溫孵育30 min，然后滴加1∶100的CRT和BAP31一抗，然后進(jìn)行室溫孵育3 h，PBS液浸洗3次，每次3～5 min；滴加二抗，每張切片滴加50 μL試劑盒中的免疫組化試劑，放入37 ℃的孵育箱中孵育30 min；PBS液沖洗切片，每次5 min，反復(fù)沖洗2次；然后進(jìn)行DAB顯色、分化、脫水、封片，隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞數(shù)。染色結(jié)果的判斷與分級(jí)：結(jié)果的判斷是根據(jù)切片的染色強(qiáng)弱程度以及陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)百分比進(jìn)行綜合評(píng)估，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，CRT主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，其陽性表達(dá)的結(jié)果是腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜中出現(xiàn)棕色或者褐色顆粒，在高倍顯微鏡(×400)下觀察切片的染色情況，隨機(jī)取10個(gè)視野的均值，對(duì)腫瘤細(xì)胞的陽性表達(dá)細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度分別進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分規(guī)則如下：(1)對(duì)組織切片中著色的陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)與腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例進(jìn)行評(píng)估，<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)根據(jù)胞質(zhì)的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：未見顯色的評(píng)為0分，顯色為淺棕色的評(píng)為1分，顯色為褐色的評(píng)為2分，顯色為黑褐色的評(píng)為3分(染色深淺均與背景著色相對(duì)比)；(3)定義上述兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘的結(jié)果為N，N≤1分評(píng)為陰性(-)，16分為強(qiáng)陽性(+++)。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，N≥2分按陽性表達(dá)計(jì)算。BAP31陽性表達(dá)的結(jié)果是腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒，在高倍顯微鏡(×400)下觀察切片的染色情況，隨機(jī)取10個(gè)視野的均值，根據(jù)參考文獻(xiàn)[4,5]，參考腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)數(shù)和染色深淺做綜合評(píng)分，即免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)=染色強(qiáng)度(SI)×陽性細(xì)胞數(shù)百分比(PP)。未見顯色的為0分，顯色為淺黃色的為1分，顯色為棕黃色的為2分，顯色為棕褐色的為3分(染色深淺與背景著色相對(duì)比)。腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)數(shù)占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例<1%定義為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。IRS<1分定義為陰性表達(dá)，IRS 1～12分定義為陽性表達(dá)，其中1～6分為弱陽性(+)，7～10分為中等陽性(++)，>10分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CRT、BAP31陽性率比較 腫瘤組、癌旁組CRT陽性率分別為88.33%、13.33%，BAP31陽性率分別為83.33%、6.67%，兩組比較，P均<0.05。

2.2 CRT、BAP31陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，CRT陽性表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P均<0.05)。

表1 CRT、BAP31陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 腫瘤組CRT與BAP31表達(dá)的相關(guān)性 腫瘤組CRT與BAP31表達(dá)無相關(guān)性(r=0.400，P>0.05)。

3 討論

CRT是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的結(jié)構(gòu)高度保守的分子伴侶和鈣離子結(jié)合蛋白，參與了人體多種生理和病理過程[6]。CRT在許多疾病中都有異常表達(dá)，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]、心血管疾病等。目前已被證實(shí)CRT在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)， CRT在胃癌中表達(dá)升高，且高表達(dá)的CRT會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且具有較差的預(yù)后[8]；在乳腺癌中CRT的表達(dá)明顯升高，并且惡性程度越高的細(xì)胞中CRT表達(dá)越高，Ⅲ期和Ⅳ期表達(dá)較Ⅰ期和Ⅱ期明顯升高[9]；在NSCLC中，有研究報(bào)道[3]顯示：CRT在鱗癌和腺癌均呈高表達(dá)，而小細(xì)胞肺癌中CRT的表達(dá)較鱗癌和腺癌卻明顯降低；王富強(qiáng)等[10]采用免疫印跡的方式檢測(cè)NSCLC組織中CRT蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRT同NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，但是目前尚未見通過免疫組化檢測(cè)NSCLC患者中CRT的表達(dá)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期的報(bào)道；研究[11]證實(shí)，CRT在NSCLC的高表達(dá)導(dǎo)致抗腫瘤免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞等)的累積增加，進(jìn)而引起抗腫瘤免疫反應(yīng)，加強(qiáng)常規(guī)抗腫瘤治療(放療和化療)的治療效果，從而對(duì)NSCLC患者的預(yù)后有較大幫助。Liu等[12]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CRT可以作為佐劑促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟，并且增強(qiáng)針對(duì)NSCLC的黑素瘤相關(guān)抗原3(MAGE-A3)的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。在NSCLC中，CRT介導(dǎo)的效應(yīng)記憶T細(xì)胞主要是CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，這些T細(xì)胞更趨向效應(yīng)記憶表型，效應(yīng)記憶T細(xì)胞記憶的細(xì)胞毒性可以控制原發(fā)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，因此而被認(rèn)為可以控制癌癥的進(jìn)展[13]；另一方面，Stoll等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CRT表達(dá)缺失的NSCLC患者預(yù)后較差。

CRT通過影響細(xì)胞黏附、遷移和侵襲從而進(jìn)一步影響腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，CRT促進(jìn)細(xì)胞黏附的機(jī)制主要是通過和整合素之間的相互作用而完成的，整合素的作用是連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架以及觸發(fā)由內(nèi)向外、由外向內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，CRT結(jié)合整合素可能影響整合素-細(xì)胞骨架之間的相互作用，從而影響細(xì)胞黏附的能力[15]，此外有研究證實(shí)鈣網(wǎng)蛋白可以通過影響胰島素受體底物1(IRS-1)磷酸化的差異而影響細(xì)胞粘附的能力[16]。由此可以看出，CRT可以通過促進(jìn)細(xì)胞粘附和遷移從而影響NSCLC的發(fā)展。

BAP31是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的多功能蛋白質(zhì)，其可以通過與免疫球蛋白(mIgM和mIgD)結(jié)合而影響其功能，并且激活B淋巴細(xì)胞[17,18]，參與了許多重要蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，但BAP31只在人體部分正常組織中低表達(dá)(除睪丸組織外)[19]，其陽性產(chǎn)物定位于胞質(zhì)，是蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要載體蛋白。1996年，Li等[20]首次發(fā)現(xiàn)了BAP31在乳腺癌中表達(dá)明顯升高；隨后Yu等[21]發(fā)現(xiàn)，BAP31在絕大多數(shù)惡性黑色素瘤中呈高表達(dá)，其總陽性率達(dá)86.5%；我國(guó)學(xué)者董令儀等[22]研究了BAP31在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，研究表明BAP31在結(jié)直腸癌中的表達(dá)陽性率為64.17%，明顯高于黏膜組織中的6.67%，高分化和沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中BAP31的表達(dá)較低分化以及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者更高，并且發(fā)現(xiàn)BAP31表達(dá)陰性患者的總體生存率明顯低于BAP31陽性表達(dá)的患者，說明BAP31可能參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過程，可能BAP31的高表達(dá)能夠通過一些通路阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，或者其介導(dǎo)的腫瘤免疫有利于患者的預(yù)后，這其中的機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步的研究。但是，目前BAP31在NSCLC中的表達(dá)無相關(guān)研究報(bào)道。

本研究通過免疫組化法檢測(cè)CRT、BAP31在NSCLC組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平同患者年齡、性別、吸煙、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期的關(guān)系，結(jié)果顯示NSCLC組的CRT和BAP31表達(dá)水平明顯升高，在正常肺組織中和癌旁組織中也有微量表達(dá)，說明CRT可能參與了NSCLC形成的過程，可能成為NSCLC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；Ⅲ+Ⅳ期患者較Ⅰ+Ⅱ期患者CRT的表達(dá)更強(qiáng)，說明CRT的表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并同TNM臨床分期相關(guān)，提示CRT可能參與了NSCLC的進(jìn)展過程，之前有研究報(bào)道[10]使用免疫印跡方式檢測(cè)CRT在NSCLC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRT在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯升高，ⅢA期較Ⅰ期、Ⅱ期明顯升高，此結(jié)果與之前研究結(jié)果一致。因此說明CRT可能成為潛在的診斷NSCLC的標(biāo)志物，并且其陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，表明其可能參與了NSCLC的進(jìn)展過程。BAP31在NSCLC中的表達(dá)同一系列臨床參數(shù)無明顯相關(guān)性，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果同前面研究報(bào)道[22]BAP31在結(jié)直腸癌中的表達(dá)結(jié)果相一致；目前，BAP31在NSCLC中發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚未闡明，需進(jìn)一步研究探討。

BAP31作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，在CRT移位至細(xì)胞膜表面的過程中起了重要作用[23]，BAP31是CRT膜轉(zhuǎn)位中必不可少的物質(zhì)，阻斷其介導(dǎo)的CRT膜轉(zhuǎn)位通路，比如BAP31表達(dá)缺失的情況下，CRT將不能移位至腫瘤細(xì)胞膜表面，從而消除了腫瘤細(xì)胞凋亡的免疫原性，減弱腫瘤放療或化療引起的抗癌免疫反應(yīng)。由此可以看出，CRT和BAP31在介導(dǎo)NSCLC的腫瘤免疫過程中起了協(xié)同作用，研究二者在NSCLC中的表達(dá)相關(guān)性可能為研究NSCLC免疫治療提供新的方向。本研究通過對(duì)CRT和BAP31在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)應(yīng)的總體相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明此兩指標(biāo)無明顯相關(guān)關(guān)系，可能跟實(shí)驗(yàn)樣本量偏小有關(guān)，更大樣本量以及更精細(xì)的分期的研究或許更有利于分析二者在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性。

總之，CRT和BAP31在NSCLC中均呈高表達(dá)，二者可能均參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且都與腫瘤免疫密切相關(guān)，因此CRT和BAP31可能成為診斷NSCLC新的生物標(biāo)志物，并且有望成為免疫檢測(cè)和治療的新靶點(diǎn)，二者介入NSCLC的機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。