秦公偉，韓豪，丁小維，，王艷龍

(1.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4.漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 漢中 723000)

藍(lán)莓是杜鵑花科越橘屬多年生灌木型果樹，果實(shí)中含有大量的花色苷、維生素等活性成分，享有國際糧農(nóng)組織賦予的“五大健康食品”之一美譽(yù)[1]。藍(lán)莓中花色苷含量豐富，是公認(rèn)的花色苷的提取源[2-3]?；ㄉ站哂卸喾N生物活性，已被應(yīng)用在醫(yī)藥、日化、保健食品等多個領(lǐng)域，對糖尿病、視網(wǎng)膜病變、纖維性囊腫、視覺障礙等都有很好的療效[4-5]?；ㄉ諔?yīng)用價值非常高，果實(shí)加工中其利用率卻很低，最多達(dá)到3.3%，分析原因主要是傳統(tǒng)的提取技術(shù)耗時長，且提取不完全，還可能是提取過程中由于高溫或者其他因素破壞花色苷結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率偏低[6]。

本文以藍(lán)莓果渣作為花色苷的提取原料，研究綠色無殘留的超臨界二氧化碳萃取技術(shù)參數(shù)，旨在為花色苷的高效利用提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓果渣(40 ℃恒溫干燥后粉碎，過60目篩，通風(fēng)干燥處保存?zhèn)溆?，陜西定軍山藍(lán)莓科技有限公司提供；乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸均為分析純；二氧化碳(99.9%)。

FW117中草藥粉末碎機(jī)；AL104電子分析天平；ST-1電熱鼓風(fēng)烘箱；SCF-CO2萃取實(shí)驗(yàn)裝置；UV-260紫外可見分光光度計。

1.2 藍(lán)莓果渣中花色苷的萃取

精確稱取藍(lán)莓果渣粉末50.00 g，裝至超臨界CO2萃取裝置釜中，于40 ℃萃取壓力30 MPa和CO2流率4.0 L/min萃取1.5 h。萃取完成后，降壓，分離花色苷，稱量計算得率。每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行驗(yàn)證，取平均值CO2循環(huán)使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溫度的影響

按照1.2節(jié)的方法，探究萃取溫度對藍(lán)莓果渣中花色苷得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 萃取溫度-花色苷得率關(guān)系圖Fig.1 Diagram of extraction temperature-anthocyanins yield

由圖1可知，萃取溫度升高，花色苷得率增大，40 ℃時達(dá)最大。升溫加快了花色苷分子的熱運(yùn)動，有利于花色苷在超臨界二氧化碳流體中的擴(kuò)散。當(dāng)萃取溫度>40 ℃時，花色苷得率有減小趨勢，花色苷屬于熱敏性物質(zhì)，過高的溫度會破壞其穩(wěn)定性，反而不利于萃取。選擇40 ℃為較佳的萃取溫度。

2.2 萃取時間的影響

按照1.2節(jié)的方法，探究萃取時間對藍(lán)莓果渣中花色苷得率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，藍(lán)莓果渣中花色苷的得率隨萃取時間的增大先增大后減小，剛開始提取藍(lán)莓果渣中花色苷時，由于提取劑(超臨界CO2)和花色苷濃度差較大，推動藍(lán)莓果渣中的花色苷向提取劑中擴(kuò)散，花色苷得率增大，萃取時間2.0 h時，花色苷得率最大，說明此時基本達(dá)到萃取飽和狀態(tài)，繼續(xù)增大萃取時間，花色苷得率反而降低，這可能是因?yàn)榛ㄉ臻L時間處于超臨界狀態(tài)下，有小部分已經(jīng)發(fā)生降解。優(yōu)選2.0 h為較佳的萃取時間。

圖2 萃取時間-花色苷得率關(guān)系圖Fig.2 Diagram of extraction time-anthocyanins yield

2.3 萃取壓力的影響

按照1.2節(jié)的方法，萃取時間2.0 h，探究萃取壓力對藍(lán)莓果渣中花色苷得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取壓力-花色苷得率關(guān)系圖Fig.3 Diagram of extraction press-anthocyanins yield

由圖3可知，萃取壓力升高花色苷得率提高。萃取壓力由30 MPa增大至35 MPa，花色苷得率變化很小，>35 MPa后，得率不增反減，可能是因?yàn)榇藭rCO2的粘度過大，對傳質(zhì)和提取產(chǎn)生了一定的副作用；再者，壓力過大也對萃取裝置提出了更高的要求。選擇30 MPa的萃取壓力較合適。

2.4 CO2流率的影響

按照1.2節(jié)的方法，萃取時間2 h，探究CO2流率對藍(lán)莓果渣中花色苷得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 CO2流率-花色苷得率關(guān)系圖Fig.4 Diagram of CO2 flow rate-anthocyanins yield

由圖4可知，CO2流率增加，藍(lán)莓果渣中花色苷得率增大，CO2流率≥4.0 L/min后，花色苷得率增大幅度非常小，給萃取后CO2的分離回收利用帶來了更大的負(fù)荷，故選擇4.5 L/min的CO2流率最合適。

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)對萃取溫度、萃取時間、萃取壓力和CO2流率4個因素進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平設(shè)計見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中共有27組實(shí)驗(yàn)，其中 1～24為析因?qū)嶒?yàn)，25～27為零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用來檢測模型的誤差。

表1 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計表Table 1 Box-Benhnken center combinationexperiment design

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface method

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance of experiment result

注：P<0.01表示極顯著，標(biāo)為**，P<0.05表示顯著，標(biāo)為*。

由表3可知，萃取時間(B)的影響極顯著，萃取壓力(C)的影響顯著。各因素對藍(lán)莓果渣中花色苷的提取的影響順序?yàn)椋狠腿r間>萃取壓力>CO2流率>萃取溫度。交互項(xiàng)中，萃取時間(B)和萃取壓力(C)、萃取壓力(C)和 CO2流率(D)兩組各自的交互作用對提取的影響均極顯著。

模型R2=95.57%，說明僅有4.43%不能被模型很好的預(yù)測和分析，模型的失擬項(xiàng)P值為0.055 4 (Pr<0.05)，不顯著，說明所建立的模型對設(shè)計涵蓋的四個因素均能很好的預(yù)測和分析，無失擬因素存在，模型的可靠性好，故此模型可用于超臨界二氧化碳萃取藍(lán)莓果渣中花色苷的預(yù)測和分析。利用模型對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，方程如下：

Y=1.467+0.012 667A+0.094 417B+0.040 25C+0.028 833D-0.210 375A2-0.047 25AB+0.005AC-0.026 25AD-0.153 75B2-0.086 5BC+0.033 5BD-0.1C2+0.081 75CD-0.269 125D2

從擬合方程可知，所有的一次項(xiàng)系數(shù)均為正，說明這四個因素均對藍(lán)莓果渣中花色苷的提取存在正向作用，二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)，因此四個因素存在一組固定值使得方程值最大。一次項(xiàng)前的系數(shù)越大，說明其對整個方程的結(jié)果影響越大，由方程式可知，萃取時間(B)所對應(yīng)的系數(shù)值最大，萃取壓力(C)所對應(yīng)的系數(shù)次之，之后為CO2流率(D)和萃取溫度(A)，這與方差分析中各因素對藍(lán)莓果渣中花色苷得率影響順序相吻合。

SAS軟件包中的程序預(yù)測所得藍(lán)莓果渣中花色苷的最高得率為1.482 194 mg/g，所對應(yīng)的四個因素的最佳值為：A=-0.000 474，B=-0.285 212，C=-0.064 45，D=0.025 597，回代入表1，求得最佳工藝條件為：萃取溫度39.997 63 ℃，萃取時間1.857 394 h，萃取壓力34.677 75 MPa，CO2流率4.512 798 5 L/min。為了方便實(shí)際操作，取萃取溫度40 ℃，萃取時間1.86 h，萃取壓力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證模型預(yù)測結(jié)果的可靠性，三次平行實(shí)驗(yàn)的花色苷得率分別為1.480 4，1.483 9，1.486 6 mg/g，平均值1.483 6 mg/g。與模型預(yù)測的最大得率誤差僅為0.095%，證實(shí)模型可靠，具有很好的預(yù)測效果，這對于大規(guī)模萃取藍(lán)莓果渣花色苷具有很好的指導(dǎo)作用，超臨界二氧化碳萃取技術(shù)綠色無污染，也利于花色苷后期的有效利用。

和文獻(xiàn)[1]的響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2萃取藍(lán)莓花色苷的得率(最優(yōu)工藝參數(shù)：萃取時間60 min，萃取溫度40 ℃，萃取壓力28 MPa，液料比為 1∶7 g/mL，花色苷得率1.58 mg/g)比較，由于本實(shí)驗(yàn)采用的原料是藍(lán)莓果渣，花色苷得率略低于未加工的藍(lán)莓。藍(lán)莓加工過程中，已經(jīng)有部分花色苷被帶走，因此藍(lán)莓果渣中的花色苷的提取相對來說較困難，萃取時間和萃取壓力均大于藍(lán)莓鮮果中花色苷的提取。比較得率可知，藍(lán)莓果渣中富含花色苷，將這部分資源更充分的提取和利用，可以大幅度提高藍(lán)莓的經(jīng)濟(jì)價值。

2.6 花色苷紫外吸收光譜及色價測定

2.6.1 花色苷紫外吸收光譜的測定 精確稱取最優(yōu)條件下萃取的花色苷0.050 0 g，放入烘箱中，40 ℃恒溫烘干至恒重。用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶解，加入一定量的pH=3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至100 mL，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，靜置1 h。精密量取1.00 mL放入100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇進(jìn)行定容，靜置1 h，用紫外分光光度計測定花色苷溶液在200～800 nm最大吸收波長，結(jié)果見圖5[7]。

圖5 花色苷紫外吸收光譜圖Fig.5 Spectrum of anthocyanins UV absorption

由圖5可知，花色苷有兩處吸收峰，分別在280.4，530.8 nm處，530.8 nm處的吸收峰更顯著，確定為最大吸收波長，色價測定也以此作為基準(zhǔn)。

表4 花色苷溶液色價測定結(jié)果Table 4 Color characteristic of anthocyanins solution

由表4可知，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解的花色苷色價最大，90%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶解的花色苷色價最小。色價越高，說明花色苷在此溶液中越易溶解。乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，極性與花色苷的極性相差越大，花色苷越難溶解。水、體積分?jǐn)?shù)60%和70%的乙醇溶液均是花色苷良好的溶劑。乙醇本身對花色苷就有一定的純化作用，可以去除花色苷中的各種雜質(zhì)，蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解的花色苷的色價相差較小，說明超臨界二氧化碳萃取得到的藍(lán)莓果渣中的花色苷純度較高，有益于后期的純化精制應(yīng)用。

3 結(jié)論

(1)超臨界二氧化碳萃取不使用任何有機(jī)溶劑，不會對環(huán)境產(chǎn)生危害，保證了花色苷的天然性，保持了花色苷的活性和固有的功效，可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化等領(lǐng)域，萃取完成后升溫降壓，分離得到的二氧化碳能循環(huán)使用，降低提取成本，是可持續(xù)應(yīng)用的高效萃取技術(shù)。

(2)超臨界二氧化碳萃取藍(lán)莓果渣中花色苷的各因素的影響順序?yàn)椋狠腿r間>萃取壓力>CO2流率>萃取溫度，優(yōu)化所得的最佳工藝參數(shù)為：萃取溫度40 ℃，萃取時間1.86 h，萃取壓力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min。此條件下，藍(lán)莓果渣中花色苷的得率達(dá)1.483 6 mg/g，與模型預(yù)測的最大得率誤差僅為0.095%。