陳志超，易 弋，趙東玲，黃翠姬，伍時(shí)華*（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；

2.廣西科技大學(xué) 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；

3.廣西科技大學(xué) 廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

全球化石能源儲備的急劇消耗，以及過度使用化石能源帶來的環(huán)境污染，這使得人們對新型清潔能源的開發(fā)以及相關(guān)的研究日趨亟切。利用玉米、木薯等淀粉類糧食作物生產(chǎn)生物乙醇，是發(fā)展生物能源的一種途徑，但這會帶來較為嚴(yán)重的糧食壓力。木質(zhì)纖維素是地球上存量巨大的生物質(zhì)資源之一，理論上可將其水解成可發(fā)酵的糖，從而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇[1]。木質(zhì)纖維素在自然界中的含量極其豐富，利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵的乙醇可緩解能源危機(jī)，同時(shí)減緩糧食壓力，確保經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，但由于技術(shù)瓶頸，木質(zhì)纖維素也是當(dāng)前利用率相對較低的生物質(zhì)資源[2]。因此，提高木質(zhì)纖維素的利用，是我國新資源發(fā)展戰(zhàn)略之一[3]。

物理化學(xué)的方法水解木質(zhì)纖維素的工藝條件苛刻，環(huán)境污染大，不適合大批量工業(yè)生產(chǎn)[4]。生物法是指直接利用微生物或微生物所產(chǎn)的酶來水解木質(zhì)纖維素。由于作用的媒介是微生物或酶，因此與物理化學(xué)法相比，生物法具有工藝條件溫和、操作簡單、耗能低、有害副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，但生物法轉(zhuǎn)化的技術(shù)依賴于高效纖維素酶的發(fā)掘。

纖維素酶在自然界中分布廣泛，存在于許多微生物、植物及昆蟲中。白蟻?zhàn)鳛橐环N以纖維素原料為食物的昆蟲，其腸道內(nèi)的微生物菌群具有發(fā)達(dá)的纖維素酶系[5-8]。有研究者已從白蟻體內(nèi)分離得到大量具有纖維素酶活性的可培養(yǎng)共生菌，并成功對白蟻的內(nèi)源性纖維素酶進(jìn)行異源表達(dá)[9-11]。黃小暉等[12]從白蟻腸道中分離出一株鏈霉菌（Streptomyces），其纖維素酶酶活為583 U/mL；李丹紅等[13]從象白蟻（Nasutitermes sp.）腸道中分離得到菌群，其纖維素酶酶活為0.5 U/mL；POURRANMEZAN Z等[14]從鋸白蟻腸道分離出芽孢桿菌（Bacillus）B5B和不動桿菌（Acinetobacter）L9B，纖維素酶酶活分別為1.47 U/mL、1.22 U/mL。

因此，本研究從廣西柳州本地的臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）體內(nèi)分離篩選一株纖維素降解菌，對其進(jìn)行鑒定，并繪制該菌株的生長曲線及測定纖維素酶活力。為生物降解纖維素方面的研究提供相關(guān)的理論依據(jù)和新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）75只：廣西科技大學(xué)校園樺樹。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母膏（生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂（生化試劑）：美國英杰Invitrogen公司；預(yù)混脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（0.1 U/μL）、膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DL5000 DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌微量生理生化鑒定管：杭州濱和微生物試劑有限公司；血平板：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩液體培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g/L，酵母提取物0.5 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，KH2PO44.0 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO40.3 g/L，纖維素鈉（c arboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）10.0 g/L，pH 7.0。

初篩固體培養(yǎng)基：在初篩液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18.0g/L。

復(fù)篩液體養(yǎng)基：CMC-Na20g/L，KH2PO42.0g/L，（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.3 g/L，F(xiàn)eSO40.005 g/L，MnSO40.016 g/L，ZnCl20.017 g/L，pH 7.0。

復(fù)篩固體培養(yǎng)基：在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18.0g/L。

濾紙降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，定量濾紙6 cm×1 cm。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.4。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，MgSO45.0 g/L，CMC-Na 10 g/L，KCl 5.0 g/L，NaNO33.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g/L，蛋白胨8.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均于121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Tpersonal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；DYY-6D型電泳儀：濟(jì)南東儀實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；ZXRD-B5210鼓風(fēng)干燥箱：上海雙旭電子有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺、HWY-2112全溫度恒溫調(diào)速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選和分離純化

初篩：分別使用無菌水和無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（Na2HPO48 mmol/L、NaCl 136 mmol/L、KH2PO42 mmol/L、KCl 2.6 mmol/L，pH=7.4）清洗臺灣乳白蟻，再將臺灣乳白蟻置于無菌研缽中研磨至糜爛狀，然后加入0.85%生理鹽水，收集研磨液。將收集的研磨液加入初篩液體培養(yǎng)基中，于37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液涂布于初篩固體培養(yǎng)基，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h。

復(fù)篩：將所得分離菌的單菌落接種于復(fù)篩液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后涂布于復(fù)篩固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)并保藏菌種，培養(yǎng)條件同上。

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)觀察：將分離菌株劃線于復(fù)篩固體培養(yǎng)基平板劃線，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h觀察單菌落形態(tài)。將分離菌株編號，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)72 h，取樣，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

生理生化鑒定：參考文獻(xiàn)[15]對分離菌株進(jìn)行生理生化測試，根據(jù)細(xì)菌生化管說明書判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

分子生物學(xué)鑒定：采用16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACTT-3′）進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：雙蒸水（ddH2O）22μL，2×Mix酶25μL，上、下游引物各1μL，菌液1μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。4 ℃條件下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆后送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，并利用Mega 7.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 濾紙降解試驗(yàn)

取分離菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)12 h，作為種子液。按1%（V/V）的接種量將種子液加入含濾紙的100 mL濾紙液體培養(yǎng)基中，37℃、100 r/min條件下培養(yǎng)6～8 d，觀察并記錄試驗(yàn)現(xiàn)象，考察菌株是否具有降解木質(zhì)纖維素的能力。

1.3.4 分離菌株生長曲線的繪制

將上述種子液按1%（V/V）的接種量接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)60 h，于不同時(shí)期取樣測定細(xì)胞生長濃度（OD600nm值）并繪制成生長曲線。

1.3.5 纖維素酶活測定

參考文獻(xiàn)[16]的測定方法并加以改進(jìn)：將反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為20 min，利用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定纖維素酶活力。以波長540 nm處吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪得線性方程為y=11.523x-0.030 2，R2=0.990 2。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到葡萄糖質(zhì)量濃度，再計(jì)算得到纖維素酶活力，其計(jì)算公式如下：

式中：M為還原糖質(zhì)量，mg；D為粗酶液稀釋倍數(shù)；T為酶促反應(yīng)時(shí)間，min；V為粗酶液體積，mL；1 000為mg轉(zhuǎn)化為μg的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

纖維素酶活單位定義：在50℃、pH 5.0條件下，1 mL酶液在1 min內(nèi)催化1%的CMC-Na生成1μg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（1 U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌篩選結(jié)果

通過初篩固體培養(yǎng)基平板分離篩選獲得3個(gè)單菌落，白色單菌落，黃色單菌落，直徑相對較小的白色單菌落，分別命名為菌株BW、BY和SW。將其接種于以CMC-Na為唯一碳源的復(fù)篩液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，之后涂布于復(fù)篩固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)獲得純化的菌落。以1%的CMC-Na為底物測得其纖維素酶活分別為93.73 U/mL、70.02 U/mL和25.93 U/mL。其中菌株BW纖維素酶酶活較高，即以菌株BW為目標(biāo)菌株。

2.2 菌株BW鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株BW的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖1。

圖1 菌株BW的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology characteristics of strain BW

由圖1a可以看出，菌株BW的菌落呈白色凸起，表面光滑、濕潤。由圖1b可以看出，菌株BW革蘭氏染色呈陰性、菌體呈桿狀、成對排列，通過菌體形態(tài)初步判斷菌株BW為桿菌。

2.2.2 生理生化特性鑒定

菌株BW的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 菌株BW的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain BW

由表1可知，菌株BW在37℃條件下可生長，而在41℃、44℃條件下無法生長，溶血性、葡萄糖產(chǎn)酸、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠水解、革蘭氏染色皆為陰性，可利用苯酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇、DL-乳酸鹽，不能利用D-蘋果酸鹽、三糖鐵。該試驗(yàn)結(jié)果與參考文獻(xiàn)[17]約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）[18]的菌種表型特性一致。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可初步確定菌株BW為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

采用菌落PCR技術(shù)擴(kuò)增菌株BW的16S rDNA序列，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株BW的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電游泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rDNA of strain BW

由圖2可知，擴(kuò)增的目的基因片段大小約為1 500 bp，與理論一致。根據(jù)BLAST序列同源性分析比對結(jié)果，選取同源性較高的菌株，采用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，菌株BW菌與約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）聚于一支，親緣性較近，同源性≥99%。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株BW為一株約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株BW的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BW based on 16S rDNA sequences

近幾年有研究者分離出一些具有特殊降解能力的不動桿菌，如可分解馬拉硫磷（硫代磷酸酯）[19]、柴油[20]、乙酰丙酮[21-22]以及在低溫堿性條件下降解脂肪特性的菌株[23-24]。而已有的針對纖維素分解菌的報(bào)道中，有關(guān)不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）的纖維素分解菌的研究相對較少。SHILRK等[24]從負(fù)泥蟲中分離出一株醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），并未準(zhǔn)確測得纖維素酶酶活大小；李靜等[25]從杜鵑林的土壤中分離鑒定獲得一株纖維素酶酶活力為71.75μmol/mL的不動桿菌屬細(xì)菌，其只鑒定到屬；EKPERIGINMM[26]從非洲大蝸牛中分離出一株無硝不動桿菌（Acinetobacter anitratus），纖維素酶活最高為0.48μmol/（mL·min）。

2.3 濾紙降解結(jié)果

菌株BW接種于濾紙液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 d后，濾紙邊緣出現(xiàn)膨脹并有彎曲，溶液稍渾濁，有較多小絮狀沉淀現(xiàn)象。從試驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果可以判定，菌株BW可降解木質(zhì)纖維素，具有一定的降解木質(zhì)纖維素的潛力。

2.4 菌株BW的生長曲線及纖維素酶活測定結(jié)果

菌株BW的生長曲線及其在不同時(shí)期的纖維素酶酶活測定結(jié)果見圖4。

圖4 菌株BW的生長曲線及纖維素酶酶活Fig.4 Growth curve and cellulase activity of strain BW

由圖4可知，菌株BW在0～10 h為遲緩期、10～20 h為對數(shù)期、20～50 h為穩(wěn)定期、50～60 h為衰退期。發(fā)酵時(shí)長20 h時(shí)，纖維素酶活達(dá)最高，為（93.73±0.22）U/mL。在纖維素降解方面有較大的潛力，對其最適產(chǎn)酶條件以及最高酶活有待進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

本研究從廣西柳州本地的臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）體內(nèi)分離純化獲得一株具有降解纖維素能力的菌株，編號為BW，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定為一株約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii），37℃、150 r/min培養(yǎng)25 h后菌體生物量達(dá)到最大，而20 h左右纖維素酶酶活達(dá)到最大，為（93.73±0.22）U/mL。為不動桿菌屬細(xì)菌在生物降解纖維素的研究方面提供了新的菌種資源。