樸怡情，申屠旭萍，葉子弘

(中國(guó)計(jì)量大學(xué)，浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

木霉素是單端孢霉烯類(lèi)化合物的一種，可抑制真核生物細(xì)胞核糖體的轉(zhuǎn)肽酶，從而影響蛋白質(zhì)的合成以及遺傳信息的傳遞，因而是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑[1,2]。同時(shí)，木霉素還能抑制多種植物病原真菌，具有廣闊的生防應(yīng)用前景[3-5]。有關(guān)木霉素在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，國(guó)外早在20世紀(jì)70年代就有相關(guān)報(bào)道[1]，國(guó)內(nèi)相關(guān)木霉素的研究報(bào)道主要集中在對(duì)農(nóng)作物病原真菌的生物防治[4]。

目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報(bào)道，也無(wú)木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品可以購(gòu)買(mǎi)，使得相關(guān)木霉素的深入研究和開(kāi)發(fā)受到了極大的限制。為此，全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)了木霉素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。我們參照ISO Guide 35:2017，依據(jù)GB/T15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品系列工作導(dǎo)則[6]，研制了木霉素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)，氣相色譜儀(Agilent GC-6890)，HYG-B恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))，TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))，WFH-203B型暗箱式紫外透射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，AB204-N電子天平(瑞士梅特勒公司)。乙酸乙酯和正丁醇等有機(jī)溶劑，均為分析純?cè)噭?杭州常青化工有限公司)；乙酸乙酯(GC檢測(cè)用，色譜純)，硅膠100-200目(青島海洋化工廠(chǎng))，GF254硅膠板(山東煙臺(tái)匯友硅膠有限公司)。

1.2 木霉素樣品的制備

以臍孢木霉菌(Trichodermabrevicompactum)發(fā)酵代謝產(chǎn)物為原料，分別經(jīng)乙酸乙酯和正丁醇溶劑提取后濃縮干燥獲得粗品，采用硅膠柱層析多次分離純化獲得純度不低于99%的木霉素純品。其中臍孢木霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物獲得采用搖瓶發(fā)酵法收集：在250 mL三角瓶中裝量60 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L牛肉浸膏，0.001 g/L ZnSO4·7H2O和0.01 g/L NH4Cl)，滅菌，待冷卻后每培養(yǎng)瓶接種1 mL臍孢木霉菌孢子懸液(含孢子為106個(gè)/mL)，置于恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間3 d。發(fā)酵液在5000 r/min下離心10 min，取上清液備用。多批次發(fā)酵，合并收集代謝產(chǎn)物約80 L，濃縮、干燥后供后續(xù)分離。

1.3 定性分析

采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)對(duì)所制備的木霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

1.4 定值分析

1.4.1 GC色譜條件

儀器：Agilent 6890氣相色譜儀；色譜柱：HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5%苯基甲基硅氧烷為固定液，30 m×320 μm×0.25 μm)；檢測(cè)器：氫火焰離子檢測(cè)器(FID)，檢測(cè)器溫度270 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫度：程序升溫，初始溫度100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至260 ℃保持5 min；載氣：氮?dú)?；流?.5 mL/min；不分流，以乙酸乙酯為溶劑[7]。

1.4.2 GC-TOF分析條件

儀器：質(zhì)譜分析采用GCT-Premier GC-TOF質(zhì)譜儀(Waters公司)測(cè)定，GC條件同1.4.1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為280 ℃，接口溫度為280 ℃，掃描范圍m/z 5-560 amu。

1.4.3 樣品溶液制備

稱(chēng)取木霉素樣品，用乙酸乙酯色譜純?nèi)芙?，質(zhì)量濃度在400～2 000 μg/mL范圍內(nèi)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 均勻性檢驗(yàn)

對(duì)同一批制備的木霉素樣品進(jìn)行分裝，按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則[6]第7章均勻性研究的要求進(jìn)行。抽樣數(shù)目為12個(gè)，按3種程序分別從每瓶中稱(chēng)取1.0 mg樣品3份，每份樣品加色譜純乙酸乙酯溶解，GC法檢測(cè)木霉素純度。3次的抽樣順序?yàn)?，3，5，7，9，11，2，4，6，8，10，12號(hào)瓶；12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1號(hào)瓶；2，4，6，8，10，12，1，3，5，7，9，11號(hào)瓶。按照1.4.1項(xiàng)GC色譜條件對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。用方差分析法對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品是否均勻。

1.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

本研究通過(guò)檢測(cè)木霉素樣品純度的變化來(lái)研究其穩(wěn)定性，以便確定有效期。樣品分裝后，于-20～-18 ℃保存。本研究以一年為期，對(duì)制備的木霉素樣品取樣檢驗(yàn)，每份試樣以測(cè)定3次的平均值為其定值結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 木霉素的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 元素分析

根據(jù)JY/T 017-1996元素分析儀方法通則進(jìn)行測(cè)試。分子式為C17H24O4，計(jì)算值：C 69.84%，H 8.27%，O 21.89%。實(shí)際測(cè)定值：C 69.88%，H 8.27%，O 21.91%。

2.1.2 紫外(UV)光譜分析

溶劑為CH3OH，紫外可見(jiàn)光區(qū)(200～800 nm)全波長(zhǎng)掃描，在205 nm處有吸收。

2.1.3 紅外(IR)光譜分析

溴化鉀壓片，紅外光譜(IR，cm-1)：2 969.21-CH3反對(duì)稱(chēng)伸縮，2 839.02-CH伸縮，1 732.92-酯鍵伸縮，1 243.04-羥基碳和甲基C-C伸縮。

2.1.4 高分辨率質(zhì)譜(MS)分析

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為280 ℃，接口溫度為280 ℃，掃描范圍m/z 5～560 amu。測(cè)得木霉素相對(duì)分子質(zhì)量為292.167 0。

2.1.5 核磁共振(NMR)分析

以氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，核磁數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1。

表1 木霉素的核磁共振數(shù)據(jù)

將木霉素的MS和NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的進(jìn)行比對(duì)，基本一致[5,8,9]，確定該化合物為木霉素，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 木霉素結(jié)構(gòu)式

2.2 純度分析

2.2.1 GC純度分析

參照1.4.1GC分析條件，對(duì)木霉素樣品進(jìn)行純度分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。扣除溶劑色譜峰后，對(duì)樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一法定量，經(jīng)積分，木霉素純度為99.82%。

圖2 木霉素GC圖

2.2.2 GC-TOF純度分析

參照1.4.2 GC-TOF分析條件，對(duì)木霉素樣品進(jìn)行純度分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。從該圖可知為單一峰，說(shuō)明木霉素純度較高。

圖3 木霉素GC-TOF圖

2.3 均勻性試驗(yàn)

將木霉素樣品進(jìn)行分裝后，對(duì)其進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 木霉素標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表3可見(jiàn)，以υ1(即組間)=11及υ2(即組內(nèi))=24，F(xiàn)=MS間/MS內(nèi)=1.42

均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb=sbb=0.003 706。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

木霉素樣品在-20～-18 ℃條件下保存，分別于0，1，2，3，6，9，12個(gè)月時(shí)各取3個(gè)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，按照1.4.1項(xiàng)色譜條件，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，用峰面積歸一化法求出純度，結(jié)果見(jiàn)表4。

從上表4數(shù)據(jù)看，測(cè)得的木霉素純度平均值在測(cè)定時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的變化不明顯，同時(shí)根據(jù)GB/T 15000-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)《標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》的要求，以直線(xiàn)模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分別采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)分析穩(wěn)定性檢驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)。具體計(jì)算如下：

表4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

t檢驗(yàn)斜率計(jì)算

直線(xiàn)的截距

直線(xiàn)上的點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差

取其平方根s=0.009 07，與斜率相關(guān)的不確定度

自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子等于2.571。

由于

|b1|

所以，斜率變化不顯著。因而木霉素樣品在一年內(nèi)是穩(wěn)定的。

有效期t=12個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度為

u=sb×t=0.000 830 2×12=0.009 962。

擴(kuò)展不確定度u1st=2u=0.009 962×2=0.019 924。

F檢驗(yàn)：上表數(shù)據(jù)(0～12個(gè)月)經(jīng)線(xiàn)性擬合，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 線(xiàn)性回歸方差分析表

線(xiàn)性回歸方差分析：從表5的數(shù)據(jù)可以看出，在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)(12個(gè)月)直線(xiàn)回歸方程的擬合度較好。經(jīng)直線(xiàn)回歸的方差分析得到F=2.29小于方差分析臨界值F0.05(1,5)=6.61。

由此確定木霉素樣品在-20～-18 ℃保存條件下，至少在12個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 定值結(jié)果及其不確定度評(píng)定

2.5.1 定值結(jié)果

木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的方法根據(jù)GB/T 15000-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》規(guī)定，選擇多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用一種方法協(xié)作進(jìn)行測(cè)定。為此我們隨機(jī)抽取16瓶樣品，分別向獲得國(guó)家或部門(mén)認(rèn)可的具備資質(zhì)的8家實(shí)驗(yàn)室送樣，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送2瓶，每瓶平行測(cè)定3次。定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，氣相色譜法測(cè)定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值。木霉素純度定值結(jié)果匯總表如表6所示。

表6 8家實(shí)驗(yàn)室木霉素純度定值數(shù)據(jù)

表7 8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)方差分析

Table 7 Analysis of variance of 8 laboratory certification data

變差源SS自由度MS組間0.007470.00106組內(nèi)0.0104400.00026總和0.017847

2.5.2 定值分析的不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測(cè)量不確定度u分別由聯(lián)合定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度uchar、均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度ults3部分組成。結(jié)合實(shí)際研究結(jié)果，木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度計(jì)算如下。

2)均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度ubb=0.003 7%。

3)穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度ults=1.99%。

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度

擴(kuò)展不確定度

=0.041 6%。

木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果：木霉素樣品的純度為99.86%，擴(kuò)展不確定度根據(jù)只進(jìn)不舍的原則統(tǒng)一小數(shù)點(diǎn)位數(shù)后為0.05%。

3 結(jié) 語(yǔ)

按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則[6]的要求，研制的木霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，均符合要求，定值結(jié)果為(99.86±0.05)%，達(dá)到了天然產(chǎn)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于木霉素含量測(cè)定、檢測(cè)方法評(píng)定、相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)與質(zhì)量控制等。