倪 雪 張根生 - 謝春麗 - 丁一丹 - 王鐵鈞 -

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

肉類是人類食用蛋白質的最佳營養(yǎng)來源之一，尤其是肉糜產品，由于其獨特的風味和口感，正被世界各地消費者大量消費[1]。因肉糜產品具有較高的商業(yè)價值，近年來不法商販為謀求利益將低檔肉摻混入其中的現(xiàn)象已變得較為普遍[2]。據(jù)報道[3]，在肯尼亞，有將野生動物肉摻入家畜肉中；在澳大利亞，有將少量袋鼠和馬肉添加到牛肉產品中；在印度，經(jīng)常有將雞肉和鴨肉摻入到羊肉中；在中國，有不法商家將雞肉，甚至將老鼠肉摻入到肉糜中。如果在肉糜中摻入一些受感染的淋巴組織，會引發(fā)健康疾??；另外在肉糜中摻入某些非肉類成分(如蛋、奶制品)，如果不加以聲明，還可能引起某些特殊人群發(fā)生過敏反應[4]。

為了解決這個問題，各種基于物理、化學、解剖學的分析方法已被采用。物理檢驗技術主要是通過觀察肉類的顏色、氣味、形態(tài)等，其結果的準確性不高，而且肉糜類產品很難通過此法進行檢驗。化學檢驗技術受肉糜種類以及屠宰后肉質變化的影響較大，檢測結果存在誤差。在肉糜摻假鑒別中，由于肉糜的狀態(tài)、摻假肉樣種類較多等問題的存在難以通過簡單的技術來檢驗。由于肉糜檢驗固有的局限性，物理檢驗技術和化學檢驗技術已被更精確、更靈敏的檢測方法所取代?，F(xiàn)如今，隨著現(xiàn)代儀器分析與分子生物學技術的發(fā)展，國內外已開發(fā)出許多用于不同肉類檢測的鑒定方法，這些方法以肉糜中的蛋白質、DNA、脂肪為研究對象，結合光譜、色譜和免疫分析等快速靈敏的檢測方法，在很大程度上提高了檢測結果的準確度[5]。文章擬綜述目前國內外肉糜產品摻假檢測的研究現(xiàn)狀，探討各種檢驗方法的優(yōu)、缺點及其適用范圍。旨在為肉糜制品的市場監(jiān)管提供依據(jù)，同時為盡快建立相應的標準體系提供一定的參考。

1 以DNA為基礎的檢驗技術

由于DNA在所有組織和細胞中的穩(wěn)定性和普遍性，基于DNA的物種識別方案獲得了更廣泛的應用。它是一種對物種的生物身份進行快速、準確鑒定的新興的物種鑒識別技術，與其他技術相比較，有著無可比擬的優(yōu)勢[6]。其原理簡單、操作方便，已被廣泛用于肉類摻假檢測當中，普通聚合酶鏈式反應(General-PCR)、多重聚合酶鏈式反應(Multiplicity-PCR)、實時聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)和熒光定量聚合酶鏈式反應(Fluorescence quantitative PCR)等一系列檢測方法都是基于DNA的檢測技術[7]。

1.1 普通PCR檢驗技術

PCR技術是指針對指定的DNA序列設計引物，使用具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，經(jīng)過體外循環(huán)擴增，實現(xiàn)目標DNA快速復制的過程，但是對于不同物種要設計不同引物，且此法通用性不好，靈敏度低，操作耗時長，存在許多不足之處[8]。

Yin等[9]探討了一種基于PCR技術檢測牦牛肉中混入牛肉的摻假技術，檢測限為0.01%，能夠很好地識別出摻假的物種。熊蕊等[10]運用PCR方法對生熟豬肉及制品中的豬源性成分進行檢測，結果表明：該方法具有較高的特異性和敏感性，可作為牛羊肉中豬源性成分快速檢測的手段，這項技術可以被應用在肉糜摻假檢測當中。朱揚等[11]研究了一種檢測在牛肉或其加工制品當中摻雜低擋豬肉的方法，根據(jù)PCR技術牛肉中摻雜的豬肉進行定性檢測，結果表明：混合肉及其他6種混合肉的檢測限均為0.1%，表明普通PCR技術可以從肉糜(混合肉)中檢測到微量的豬肉成分。Langen等[12]通過PCR方法半定量檢測肉制品當中的豬源性成分，檢測限可以達到0.1%，該方法可以被用來檢測肉糜產品中摻假的豬肉。

1.2 實時PCR檢驗技術

傳統(tǒng)的PCR通常能夠對鑒定出的物種產生定性結果，而實時PCR技術已被證明是一種有效檢測小分子質量的工具。在一些復雜的食物中，實時PCR可能是最常用的基于DNA的定量方法，運用實時PCR檢測技術能更好地檢測出肉糜中摻假的肉類品種。但是，設備和試劑的高成本仍然是該技術廣泛應用的一個缺點。實時聚合酶鏈反應(Real-time PCR)在物種鑒定和食品中DNA含量的定量分析方面具有重要的應用價值[13]。

Kang等[14]建立了一種新的基于參考引物的實時定量PCR技術，能夠定量檢測豬肉和羊肉的摻假，定性檢測山羊肉與未知動物肉類的摻假。劉岑杰等[15]應用熒光定量PCR檢測技術對肉制品中的鴨源性成分進行了檢測，建立了檢測鴨肉成分的熒光定量PCR技術。結果表明：該方法的特異性好，最低檢出限為0.01%，靈敏度較高，同時對市售羊肉串、預制牛肉片等7種樣品進行盲樣檢測，結果均含有鴨源性成分，發(fā)現(xiàn)了大量使用鴨肉摻假的行為，為肉糜摻假的研究提供了很好的依據(jù)。Mohamad等[16]應用實時定量PCR研究比較了豬肉的基因性質，為食品中豬DNA的檢測和計算提供了一種靈敏的自動物種識別方法。Meira等[17]采用實時PCR方法定性和定量測定加工食品中馬肉的摻假，檢測牛肉糜中馬肉摻假情況的靈敏度和特異性分別為0.000 1%和0.1 pg。馮永巍等[18]的研究中也對實時PCR檢測技術鑒定肉類品種進行了報道。

1.3 多重PCR檢驗技術

由于DNA與蛋白質相比有較高的穩(wěn)定性，以DNA為基礎的多重PCR檢測技術提供了一種快速、靈敏可以替代蛋白質的方法[19]。并且能夠同時檢測多個物種的一種簡單且高特異性的方法。

Xu等[20]研究建立了一種多重鎖相核酸實時聚合酶鏈反應，用此法檢測肉源中混入的鴨肉、豬肉、牛肉和雞肉，結果顯示各物種檢測限達到0.01%，是一種高通量、靈敏、特異的可用于肉類及肉制品中多種肉源的鑒別方法。Thanakiatkrai等[21]成功開發(fā)了一種直接3倍實時PCR檢方法，可以快速(1 h內)、準確地識別出6種肉類，而且分析成本低，具備在食品檢測實驗室推廣的潛力。Ali等[22]運用多重PCR技術對伊斯蘭教中禁用的5種肉(貓、狗、豬、猴和大鼠肉)進行檢測，對所有PCR產物在凝膠圖像和電子色譜圖中進行鑒定，可以篩選出受損害狀態(tài)和復雜基質條件下的目標物種。Prusakova等[23]應用多重PCR同時檢驗肉制品中5種常見食用肉和5種常見的禁用肉，所建立的多重PCR方法特異性強，每次反應靈敏度可達30 pg。何海寧等[24]運用多重PCR技術檢測牛肉中摻雜的豬肉、鴨肉，該法能夠同時測定這3種摻假肉當中的任意兩種，是一種準確快速的肉類檢測方法。Hou等[25]通過檢測牛肉、豬肉、羊肉和鵪鶉肉制品中摻雜的雞、鴨和鵝的DNA，運用多重PCR方法同時鑒定這3種肉，即使在目標DNA含量為0.05 ng或目標肉含量為0的情況下，該方法也能夠在原料和加工肉制品中同時識別雞、鴨和鵝3種摻雜在目標肉當中的摻假肉，具有較高的靈敏度。

2 以蛋白質為基礎的檢驗方法

基于蛋白質的方法是根據(jù)樣品中特定蛋白質的檢測水平來識別不同類型肉類物種起源的技術。色譜、光譜以及電泳檢測技術都是以蛋白質為基礎的測定方法[1]。

2.1 色譜方法檢驗技術

2.1.1 氣相色譜檢驗技術 食品中肉類檢驗的方法越來越多，通過氣相色譜檢測肉糜當中的摻假肉仍是一種高效可取的辦法。Nurjuliana等[26]使用頂空分析(GCMS-HS)的電子鼻和氣相色譜質譜儀研究豬肉和其他肉制品的揮發(fā)性化合物，將其成功用于鑒別和區(qū)分牛肉、羊肉、雞肉和豬肉。Wang等[27]建立一種利用電子鼻和氣相色譜—質譜聯(lián)用技術鑒別劣質鴨肉在羊肉中摻假的方法，采用費希爾線性判別分析(FLDA)和線性回歸擬合分析對預處理結果進行定性和定量分析，該方法證明利用E-nose 快速檢測羊肉摻假鴨肉具有較高的準確性，減少了檢測時間，提高了檢測效率，在鑒別摻假肉樣品方面有很大的應用前景。Dimitrios等[28]通過采集牛肉、豬肉和混合肉(70%的牛肉和30%的豬肉)，對其進行頂部空間分析。運用液相微萃取與氣相色譜—質譜聯(lián)用(HS-SPME/GC-MS)技術，提出了一種基于肉糜中揮發(fā)組分的鑒別方法，建立的兩個分類數(shù)據(jù)模型中，總體正確分類率平均為99%。結果表明，此研究中所采用的揮發(fā)組學方法可以作為一種可靠的鑒別方法，在離線模式下也可對肉類樣品進行分類。

2.1.2 液相色譜檢驗技術 基于液相與質譜聯(lián)用(LC-MS)的方法比基于酶聯(lián)免疫吸法(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)的方法更精準。此外，液質聯(lián)用法(LC-MS)能夠在一次運行當中檢測出十幾種不同的肉類物種，更加方便快捷。Fornal等[29]提出了一種基于物種特異性肽段的液質聯(lián)用(LC-MS)多重反應檢測方法用于鴨肉、鵝肉和雞肉的檢測，結果顯示：該方法能夠成功地檢測出混合肉樣中的雞肉、鴨肉、鵝肉，能夠對加工食品進行定性篩選。Chou等[30]建立了一種既快速又經(jīng)濟的能夠對多品種肉類進行檢測的高效液相色譜—電化學檢測方法，補充了現(xiàn)有的肉類物種分化鑒定方法。該法能夠同時區(qū)分15種常見的肉類，這種情況很罕見，根據(jù)物種的特征峰進行摻假鑒定是一種可取的鑒定方向。李瑩瑩等[31]利用液相色譜—串聯(lián)質譜法構建的多肽識別技術來鑒定羊肉中摻雜鴨肉，該方法測定結果與摻假模擬試驗的真實值較為接近，是一種快速、靈敏、準確檢測羊肉中摻雜鴨肉的方法。

2.2 光譜分析方法檢驗技術

光譜分析檢測方法主要包括傅里葉近紅外光譜(FTIR)、紫外可見光(UV-vis)、近紅外(NIR)、中紅外(MIR)光譜技術，光譜結合化學計量學技術檢測肉糜的摻假現(xiàn)象已被普遍應用[32]。利用激光誘導擊穿光譜法也已成為時下應用較多的一種摻假檢測技術，具有快速、低成本、對樣品要求低、適于工業(yè)檢測等優(yōu)點[33]。

2.2.1 近紅外光譜 近紅外光譜作為一種非選擇性的分析技術，被認為是對傳統(tǒng)鑒定方法快速、可靠的支持，近紅外光譜更適用于質量控制，因其儀器可以配備光纖探針，僅需通過表面接觸就可以評估樣品。張玉華等[34]采用近紅外光譜結合主成分分析(PCA)、判別分析法對摻雜在牛、羊肉糜中的低檔肉進行分析，用其所建模型得出：牛肉摻豬肉鑒別模型、羊肉摻豬肉鑒別模型、羊肉摻鴨肉鑒別模型、羊肉摻假鑒別模型的鑒別準確率均達90%以上，表明建立的定性檢測模型能夠清晰地區(qū)分純肉與摻假肉。Zheng等[35]也利用近紅外光譜檢測肉糜中的鴨肉摻假情況，結果表明在一定的樣本范圍內，所建立的最優(yōu)模型具有一定的適用性，此研究成果可以引入到生產實踐中。Alamprese等[36]研究了一種基于傅立葉—近紅外光譜和多元分析的肉糜中摻雜火雞肉的鑒別和定量方法。結果表明，傅立葉—近紅外光譜與合適的化學計量學方法相結合，是鑒定和定量肉糜的可靠方法。

2.2.2 中紅外光譜 中紅外光譜是一種高質量篩選方法，中紅外區(qū)域提供了大量分析物的信息，吸收帶對于單個成分的物理和化學狀態(tài)很敏感。Al-Jowder等[37]研究了中紅外光譜檢測牛肉、牛肉肉糜和某些內臟摻假方面的應用，結果顯示：中紅外光譜可用于不同的肉糜、牛腎、牛肝的檢測分析。Schmutzler等[38]采用傅里葉紅外光譜法檢測牛肉制品中的豬肉摻假現(xiàn)象，通過對樣品采用雙層聚合物包裝，經(jīng)過測定分析可檢測出不同比例的豬肉摻假情況。中紅外光譜在肉糜摻假檢測中的應用較少，未來可以考慮利用其進行更系統(tǒng)的研究。

2.2.3 激光誘導擊穿光譜 激光誘導擊穿光譜近年來在各行各業(yè)當中都起著不同的作用，其操作過程簡單快速，樣品的蒸發(fā)和激化可以一次性完成，可以對樣品中的多種元素進行同時分析，節(jié)約時間，對肉糜等物質進行分析時利用對每種肉樣當中含有的特征物質進行分析，能夠實現(xiàn)肉糜中摻雜低檔肉的檢測。Velioglu等[39]研究了肉糜中的摻假成分，利用激光誘導擊穿光譜法對牛肉和內臟樣品進行鑒別和定量。用主成分分析法(PCA)對摻假的純內臟和內臟混合物進行了判別，利用偏最小二乘法(PLS)確定摻假率，測定系數(shù)(R2)為0.947，檢出限(LOD)值達到了3.8%。Bilge等[40]也采用激光誘導擊穿光譜法根據(jù)肉種間元素組成的差異進行肉的鑒別，采用PCA對肉進行定性鑒別，其比例為83.37%，再采用PLS定量分析豬肉摻假牛肉的情況，測定系數(shù)(R2)和檢出限(LOD)分別達到了0.994和4.4%。

3 免疫學方法

當前，肉糜的摻假鑒別，由于組成復雜以及形態(tài)特征的缺乏，常使用化學計量法、色譜法和電泳方法來解決肉糜真實性問題，但是每種方法都有各自的局限性。最普遍的肉糜鑒定方法是以蛋白質為檢測對象的免疫檢測法。免疫檢測法具有很高的靈敏度和高效的處理能力，在短時間內能夠處理大量的樣本，但該方法在某些情況下，會有一些限制，如近源物種之間的交叉反應。免疫分析法是一種分析測量技術，使用抗體或抗原作為檢測試劑，優(yōu)于傳統(tǒng)方法。但是不能夠對物種水平進行鑒定，主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定、放射免疫測定法、血凝抑制測定法、瓊脂凝膠免疫擴散法。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法

食品分析中最常用的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分為非競爭性間接法、夾心法以及競爭性法。間接法和雙抗體夾心法具有鑒別肉用原料的潛力，其靈敏度在0.1%～10.0%。通常用夾心ELISA法鑒別近緣物種，競爭ELISA法檢測溫和加熱肉制品中肉類的種源。

Dincer等[41]用競爭性和間接酶聯(lián)免疫技術檢測牛肉中的摻假問題，兩種方法都能檢測到牛肉中摻雜的5%豬肉或羊肉。Mandli等[42]采用兩種酶聯(lián)免疫吸附試驗，建立了ELISA/免疫傳感器對肉制品中豬肉摻假的敏感檢測方法。通過固定免疫球蛋白G(IgG)標準，建立競爭性ELISA，該方法可在45 min內檢測出0.1%的豬肉摻假。兩種競爭性免疫檢測方法的靈敏度高、特異性好、分析時間短。Kuswandi等[43]建立了一種快速免疫條帶檢測方法，用于檢測加工肉制品中摻假的豬肉，該條帶為檢測加工肉類樣品中的豬肉摻假提供了一種簡便的方法，具有較高的可靠性。該團隊研制的橫向流動免疫傳感器，可用于肉制品中豬肉摻假的目視檢測，免疫傳感器條帶檢測限為0.1%，此方法可用于檢測肉丸中較低水平的豬肉摻假。Sheila等[44]應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測牛肉中摻雜的微量豬肉。Martin等[45]通過試驗將馬的抗血清免疫吸附到雞、牛和豬的固定肌漿提取物上，去除交叉反應抗體，應用建立的雙抗體夾心ELISA法，檢測混合肉中定量的馬肉，檢測結果較好。

3.2 其他免疫測定法

近年來，免疫測定法主要集中在酶聯(lián)免疫吸附法，對于其他以免疫測定的方法研究肉類摻假的報道較少。血凝抑制測定主要用于測量抗流感病毒的保護性抗體應答水平[46]。瓊脂免疫凝膠測定法是一種簡單可靠的血清學檢測方法，主要應用在醫(yī)學領域，在肉類摻假領域鮮有研究，其基礎是抗原的均勻性和永久性，保證了其在獸醫(yī)診斷中的應用和適用性[47]。放射性免疫測定是一種簡便、靈敏、特異的測定方法，主要應用于動物種屬的臨床研究。直接放射免疫法是一種方便的直接分析方法，多被用于研究大鼠體內的藥代動力學，主要優(yōu)點是所需的樣品體積很小，不需要繁瑣的樣品準備步驟[48]。

4 電泳聯(lián)合檢驗技術

相對于氣相色譜法，電泳法是一種很有前景的食品檢測方法。幾種常見的電泳方法，如毛細管電泳(CE)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電子聚焦(IEF)以及脈沖電泳。通常是將不同動物物種的可溶性蛋白質分離成不同的條帶來進行比較，但是單一的電泳檢測技術不能夠很好地檢測肉糜當中的摻假物，往往需要與其他檢測技術聯(lián)合使用，以達到更好的檢測效果。

毛細管電泳法的靈敏度高、所需樣品的體積量小、不會造成損失。Juan等[49]應用聚酶鏈式反應和毛細管電泳(PCR-CGE)方法，檢測豬肉制品當中摻雜的雞肉，在1%的最低混合水平下，肉類混合物中獲得了顯著的熒光信號，表明通過此法建立的檢測方法能夠用于檢測豬肉加工產品中的常見家禽肉。Vallejo-Cordoba等[50]在實驗室通過使用十二烷基硫酸鈉聚合物填充毛細管凝膠電泳(CE-SDS)來表征、比較和量化牛和鴕鳥肌肉中的水溶性蛋白(WSP)和鹽溶性蛋白(SSP)組分，比較兩者的水溶性蛋白(WSP)圖譜在定性和定量上的差異，可知二者蛋白質之間存在差異。比較它們的蛋白質譜，有助于進行肉類物種的分化。任冬霞等[51]也利用毛細管電泳檢測技術對豬、牛、雞、鴨肉進行了摻假檢測，通過其中一種動物的特異性引物對其他3種動物的基因組進行DNA擴增，對其毛細管電泳圖譜進行分析，結果顯示試驗的特異性較高。

脈沖電化學檢驗(PED)技術是一種高靈敏度、高選擇性的檢測技術，由于其固有的敏感性和兼容性該技術已在毒理學、環(huán)境和制藥等領域得到了廣泛的應用[52]。由于其被公認為是分析有機脂肪族化合物的主要檢測方法，未來將其應用在肉糜摻假的檢測中有很大發(fā)展前景。在印度，由于羊肉的成本較低而且容易被獲得，常常被摻入水牛肉當中。Basappa等[53]利用物種的特異性，驗證了牛、水牛和綿羊肉及其混合物在未加工和熟制條件下的肉種類別，證明了基于電泳—質譜的蛋白質組學方法在肉品鑒定中的適用性，此研究中提到的高通量蛋白質組學與電泳相結合的方法具有一定的穩(wěn)健性，可替代基于DNA的肉類檢測方法。

5 結語

肉糜產品在當前人們的生活中扮演著不可或缺的角色，摻假問題卻日漸嚴重。文章所述的檢測方法在某些條件下有一定的限制性，例如基于蛋白質的方法受到蛋白質在熱處理時易變性、操作時復雜的限制，還沒有被廣泛應用；基于DNA方法靈敏度較高，操作過程卻比較繁瑣；光譜檢測技術雖然是目前為止使用較普遍的方法，但存在靈敏度較低的問題，未來應該深入研究改善其靈敏度。