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(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西 楊凌 712100)

種子是作物生產(chǎn)的基本材料，高質量種子是保障作物高產(chǎn)的關鍵因素[1]。種子活力是綜合反映種子質量的重要指標，決定種子在多變的田間條件下快速均勻出苗和發(fā)育的潛力，是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。大田生產(chǎn)條件下,高活力種子出苗整齊一致，出苗速度快，確保了苗齊苗壯，為高產(chǎn)奠定了基礎，同時有利于遏制雜草滋生。低活力種子則出苗不齊，出苗速度慢，易造成缺苗斷壟，致使作物減產(chǎn)。種子活力不僅影響作物田間的成苗與生長情況，也反映了種子對不良環(huán)境因子的適應能力[2]。喬燕祥等[3]研究發(fā)現(xiàn)同一種作物不同品種的種子活力差異明顯，抗老化和耐貯性各異。

種子活力的評價方法可分為直接法和間接法兩類。直接法是觀測種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)和幼苗質量等形態(tài)特征。間接法則是測定種子浸出液的電導率、丙二醛含量、抗氧化酶活性和淀粉酶活性等與種子活力相關的生理生化指標。《國際種子檢驗規(guī)程》對這些方法進行了描述和推薦[4]，為準確進行不同作物的種子活力檢測提供了標準。

小麥是我國第三大糧食作物，2017年全國小麥種植面積約為0.24億hm2。小麥產(chǎn)量的多少直接關系到我國的糧食安全。篩選和應用高種子活力小麥品種對確保小麥田間出苗率，提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。本研究以置于常溫種子庫老化6年的180個小麥品種(系)的種子為材料，分別進行了發(fā)芽率、電導率、含水量和籽粒品質性狀的測定，對電導率、含水量、總蛋白和淀粉含量與發(fā)芽率之間的相關性進行了分析，并對種子活力高低差異顯著的6個品種進行了內源激素含量的測定和分析，以期揭示不同小麥品種(系)間種子活力差異及其內在生理原因，為小麥種子活力的研究和高活力品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本實驗室保存的180個不同小麥品種(系)的種子，這些品種(系)主要來自陜西、河南、山東和江蘇等省份。2009年10月將180個小麥材料播種于西北農(nóng)林科技大學楊凌試驗農(nóng)場，每個材料種2行，行長1 m，株距5 cm，行距25 cm，期間進行防病、防蟲處理，2010年6月各材料單收單脫后進行充分晾曬，直至種子含水量降至10%左右。種子過8目種子篩，去除破損籽粒和雜質后裝入紙質種子袋，置于木質種子柜中室溫貯藏6年。

1.2 種子發(fā)芽率的測定

2016年10月，用2%次氯酸鈉(NaClO)對貯藏6年的種子進行消毒處理，置入鋪有2層濾紙作發(fā)芽床的發(fā)芽盒(規(guī)格為：11.5 cm×11.5 cm×5 cm)中，將發(fā)芽盒放入RXZ型智能人工氣候室中進行萌發(fā)實驗，人工氣候室設定溫度為22 ℃，濕度60%。發(fā)芽試驗設3個重復，每個重復100粒，發(fā)芽過程中適時補水，發(fā)芽第7天統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.3 種子電導率測定

采用雷磁DDS-307電導率儀進行測定，以蒸餾水為空白對照(L0)，每個品種(系)隨機選取50粒均勻完整的種子稱重(m)，用蒸餾水沖洗3次，放入含有250 mL蒸餾水的燒杯中，20 ℃浸泡24 h后測定其電導率(L1)，100 ℃處理30 min，待冷卻后補充蒸餾水至原來位置，再次測定其電導率(L2)。分別按以下公式計算電導率、相對電導率、絕對電導率：

1.4 種子含水量和籽粒品質性狀測定

用Perten DA 7250谷物近紅外分析儀測定180個小麥品種(系)的種子含水量、蛋白質和淀粉含量，每個品種(系)取10 g干種子，進行3次重復試驗。

1.5 種子激素含量測定

根據(jù)發(fā)芽率測定結果從180個小麥材料中篩選種子活力最高和最低的小麥品種各3個，分別取3粒種子放入研缽中磨碎，稱取0.1 g樣本，加入1 mL預冷的80%甲醇，4 ℃浸提過夜(12 h)。4 ℃，8 000 g條件下離心15 min，取上清液置于4 ℃保存。殘渣再用0.5 mL預冷的80%甲醇浸提2 h，再次離心15 min(4 ℃，8 000 g)后取上清液，合并2次上清液。并在40 ℃條件下旋轉減壓蒸發(fā)至不含有機相(約剩0.3 mL水溶液)，加入0.1 g PVPP吸附酚類及色素，并于4 ℃下振蕩1 h，以8 000 g/min離心10 min，棄去雜質。以2 MHCl 調 pH值至2.5，用等體積乙酸乙酯萃取3次，將有機相(即乙酸乙酯相)轉移至新的離心管中，氮吹至干，加入0.5 mL甲醇溶解,用0.45μm濾膜的針頭式過濾器過濾于液相樣品瓶內待測。

表1 供試小麥品種(系)

激素含量測定采用安裝有Kromasil C 18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的Rigol L 3000高效液相色譜儀進行測定，柱溫為35 ℃，進樣量為10μL，流速為0.8 mL/min；用甲醇和0.6%冰醋酸作流動相進行梯度洗脫；走樣時間為30 min，檢測波長為UV 254 nm；定量方法為外標校準曲線法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各項測定結果采用Excel 2016軟件進行計算，用R(version 3.5.0)對發(fā)芽率結果進行標準化處理并聚類分析，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析、線性回歸分析和獨立樣本T檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同小麥品種(系)間種子自然老化后的種子活力分析

發(fā)芽率與種子活力呈正相關關系，是反映種子活力最為直接的指標。因此，以常溫種子庫老化6年的種子發(fā)芽率為指標來評價種子活力的高低。種子發(fā)芽率測定表明，經(jīng)過6年的自然老化后，180個小麥品種(系)的平均發(fā)芽率降低至11.16%。不同小麥材料之間的發(fā)芽率存在較大差異，64.64%的品種(系)發(fā)芽率降低至10%以下，其中35個材料(接近1/5比例)完全喪失發(fā)芽能力，發(fā)芽率在50%以上的僅有7個品種，僅占總數(shù)的 3.87%，其中豫麥18的發(fā)芽率(92%)最高，種子活力最強，其次是西農(nóng)3517(76%)和瀏虎98(72%)。

圖1 180個小麥品種(系)發(fā)芽率的頻率分布

以貯藏6年后的種子發(fā)芽率為指標，運用R語言對數(shù)據(jù)進行了標準化處理，采用層次聚類法對180個樣品(系)進行聚類分析(圖2)。180個小麥品種(系)被聚成兩大類群，第Ⅰ大類群由14個品種(系)組成，其種子發(fā)芽率較高，發(fā)芽率分布范圍為42%～92%，這一類群又細分為2個亞類，豫麥18、西農(nóng)3517和瀏虎18共3個品種發(fā)芽率最高，為Ⅰa亞類，其他為Ⅰb亞類；第Ⅱ大類群共166個品種(系)，這些品種(系)種子發(fā)芽率較低，種子活力較低，其中以19%的發(fā)芽率為界線分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類。

續(xù)表1

編號品種(系)名 編號品種(系)名 編號品種(系)名 編號品種(系)名 9307-804115遠豐139137豫同69159XN10-29407-423116西農(nóng)1376138TM3698160周黑麥1號9504-0502117西農(nóng)386139西農(nóng)0210161周麥2496西農(nóng)2001118綿陽35140鄭育麥9987162周992339703-4083矮119遠豐175141關東107163濟麥229802-1090120周98165142加豐164濟麥209903-4083121周17143中4165周麥25100鄭麥366122美麥DNS144科農(nóng)181166武農(nóng)986101R112304Rd-1145西農(nóng)4211167西農(nóng)886102花培5號124周麥16146加大穗168XN10-1103N9820125J-1B147西農(nóng)198169A189104衡562126豫麥18148日本百火170A323105衡5127秦農(nóng)126149山農(nóng)18171豐收60106N9817128陜556150山農(nóng)14172皖麥9908107衡5364129西農(nóng)837151陜糯1號173淮麥0308108衡矮130西農(nóng)3399152西農(nóng)939174阜98-46109早熟6061131煙農(nóng)19153豫農(nóng)94917580909110西農(nóng)501132小偃270154泰山23176陜319111LK78-3R133R164155342177咸陽2344112A177134濮麥9號156陜墾99178陜354113分33135陜麥94157384179陜農(nóng)28114225-21136澳標白麥158116-422180陜農(nóng)33

2.2 種子活力與電導率間的相關分析

發(fā)芽率與電導率的相關分析表明，發(fā)芽率與電導率和絕對電導率分別呈極顯著和顯著負相關(表2)，說明電導率的測定可以較好地評估小麥種子活力。由于相對電導率與萌發(fā)率相關不顯著，僅對電導率和絕對電導率與發(fā)芽率進行了線性回歸分析。

表2 小麥種子發(fā)芽率與電導率的相關性

注：“*”表示在0.05水平上顯著相關，“**”表示在0.01水平上極顯著相關。下同。

根據(jù)電導率與發(fā)芽率的散點分布，電導率最高為16.454μS/m，最低為3.558μS/m。不同小麥品種(系)在6年自然老化條件下，品種差異雖然明顯，但普遍集中于一個區(qū)域，即在電導率4～10μS/m之間，發(fā)芽率在20%以下；而絕對電導率最高可達29.219μS/m，最低為5.062μS/m，點富集在電導率5～20μS/m之間，20%的發(fā)芽率以下。兩者的線性回歸方程說明了不同小麥品種(系)間電導率、絕對電導率和發(fā)芽率的顯著負相關性。發(fā)芽率越低，電導率和絕對電導率越高，說明老化種子發(fā)芽率降低可能是由于細胞膜在貯藏過程中氧化受損導致的。

2.3 種子活力與含水量、籽粒品質性狀間的相關分析

對貯藏6年的180個小麥品種(系)進行發(fā)芽率與含水量、籽粒品質性狀間的相關性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與種子淀粉含量呈極顯著負相關，相關系數(shù)達到r=-0.356(p<0.01) ，與水分含量呈顯著負相關，相關系數(shù)為r=-0.183(p<0.05)，而與種子蛋白質含量相關不顯著。

表3 小麥種子萌發(fā)與含水量、籽粒品質性狀間的相關分析

圖2 180個小麥品種(系)發(fā)芽率的聚類分析圖

將聚類分析的Ⅰ和Ⅱ兩類群品種籽粒的水分、蛋白質和淀粉含量進行獨立樣本T檢驗，發(fā)現(xiàn)不同類群間品種種子的水分和蛋白質含量差異不顯著，但淀粉含量存在極顯著差異。

2.4 種子活力與內源激素含量間的關系

種子內源激素是影響種子萌發(fā)的關鍵因素，為了進一步揭示造成種子活力變化的內在生理基礎。從180個小麥品種(系)中挑選出種子活力最高和最低的小麥品種各3個進行GA3和ABA激素含量測定， 結果表明，3個高活力品種種子的GA3含量均明顯高于低活力種子的，不同品種間種子ABA含量與種子活力間無明顯對應關系；但GA3/ABA比值在種子活力高、低不同的品種間差異明顯，3個高活力品種種子的GA3/ABA比值均大于0.9，而3個低活力種子的GA3/ABA比值則分布在0.5～0.7之間，后者明顯低于前者，另外，3個高活力品種發(fā)芽率的高低排序與GA3/ABA比值的高低排序也一致，如，豫麥18發(fā)芽率最高，GA3/ABA比值也最高，然后依次為西農(nóng)3517和瀏虎98(表4)。以上結果表明，小麥品種種子的GA3含量和GA3/ABA比值對種子萌發(fā)影響較大，這與前人研究相一致。

圖3 不同小麥品種(系)的種子電導率與發(fā)芽率的線性回歸圖

圖4 不同小麥品種(系)的種子絕對電導率與發(fā)芽率的線性回歸圖

表4 種子活力高、低不同小麥品種間種子發(fā)芽率和相關激素含量比較

注：小寫字母表示在0.05水平上顯著性差異，大寫字母表示在0.01水平上極顯著性差異。

3 討 論

成熟干燥種子的代謝處于相對停滯狀態(tài)，但一旦受到發(fā)芽誘導則細胞代謝被重新激活，最終促成種子萌發(fā)，因此種子內必然存在長期維持這種低代謝活性狀態(tài)的機制[5]。種子的代謝活動受到自然氧化環(huán)境的影響會發(fā)生一系列的生理生化反應，其中包括ROS和有毒物質的積累、蛋白質的氧化和核酸的損傷、合成及修復能力的降低等[6]。種子活力的形成和維持既受遺傳因素的影響，也受環(huán)境因素及貯藏條件的影響。種子在老化過程中會發(fā)生一系列劣變，如細胞膜在自然氧化下受到損傷、發(fā)芽遲緩、發(fā)芽率下降、萌發(fā)過程中對逆境的耐受性下降等[7]，氧化損傷的不斷積累和種子抵抗和修復損害的能力變弱，最終會導致種子活力的喪失[8-9]。本研究中，180個小麥品種(系)經(jīng)過6年自然老化，大部分種子的活力明顯下降，平均發(fā)芽率僅為11%，有近五分之一品種的種子完全喪失萌發(fā)力，但也有少數(shù)品種仍表現(xiàn)出較高的種子活力。由此可見，經(jīng)自然老化后品種間的萌發(fā)率差異顯著，這主要是由于品種間的遺傳與生理上的差異造成的。

種子在老化過程中，細胞膜氧化受損，通透性增大導致胞內物質滲出[10-11]，影響種子壽命，壽命較長的種子其細胞膜趨于更穩(wěn)定[12]。種子吸脹初期，細胞膜重建和損傷修復的能力影響電解質和可溶性物質外滲的程度，膜修復越快，外滲物質越少，電導率也越低。因此種子浸出液的電導率能較好地評價種子的質量和耐貯性。隨著老化時間的加長，種子的細胞膜受損加重，種子浸出液的電導率都會出現(xiàn)不同程度的持續(xù)上升現(xiàn)象，但不同基因型小麥品種間差異較大[13-15]。本研究對自然老化后的180個不同小麥品種(系)的種子浸出液進行電導率、相對電導率和絕對電導率的測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與電導率呈極顯著負相關，與絕對電導率呈顯著負相關，而與相對電導率相關不顯著。對同一品種隨老化程度加劇電導率的變化尚待進一步研究。

水分是影響種子生化老化反應的主要因素之一[16]，本研究發(fā)現(xiàn)，6年自然老化后小麥品種(系)的種子水分含量與發(fā)芽率呈顯著負相關，隨著老化后種子含水量的增加，種子壽命顯著縮短。在成熟的干燥種子中發(fā)現(xiàn)，種子含水量低導致細胞質高度粘稠[17]，代謝減少，呼吸作用微弱，大部分酶處于鈍化狀態(tài)，生理活動受到抑制，能量消耗維持在較低水平[18]；種子含水量高且處于有氧條件下會引起一系列的代謝變化，例如呼吸增加、活性氧積累、膜完整性喪失和儲備物質(蛋白質和糖含量)消耗加快，從而導致種子活力降低[19-20]，本研究證實了這些結果。

種子老化后其發(fā)芽率與淀粉含量呈極顯著負相關，而與蛋白質含量相關不顯著。Rajjou等研究表明，盡管干燥種子的代謝相對靜滯，但是在成熟種子的貯藏期間會發(fā)生分子和代謝變化[6]。在長期自然老化過程中，小麥種子貯藏物質如糖類、蛋白質代謝經(jīng)歷了動態(tài)變化的過程，這兩者對種子的萌發(fā)都有著極其重要的作用。根據(jù)前人的研究，種子中淀粉和蛋白質含量會隨著老化程度的加深而減少[21-22]。小麥種子經(jīng)過6年貯藏，高活力種子中淀粉含量明顯低于小麥種子正常的淀粉含量范圍(57%～75%)[23]，失活種子的代謝終止，淀粉消耗停止，而未失活的種子仍維持著休眠狀態(tài)的呼吸，淀粉含量隨老化時間加長而明顯減少，因而在貯藏6年的小麥品種(系)中淀粉含量與發(fā)芽率呈負相關，說明儲藏物質代謝的維持對小麥種子壽命起重要作用。

植物的生長發(fā)育受多種激素之間復雜的相互作用調控，其中包括種子的休眠與萌發(fā)。赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)是調控該相關生理過程的的兩大關鍵激素，兩者拮抗互作介導種子的休眠和萌發(fā)過程[24]。GA3能打破種子休眠，提高種子體內IAA的含量從而誘導α-淀粉酶的活性，加速胚乳中淀粉水解，促進種子發(fā)芽。而ABA通過抑制吸水從而抑制細胞壁松動來限制胚的生長潛力，這是誘導種子休眠并限制萌發(fā)的關鍵步驟[25]。GA3與ABA的合成及信號傳導并非獨立，而是彼此互作。實質上，控制種子休眠和萌發(fā)并非取決于GA3和ABA激素的絕對含量，而是取決于兩者的相對含量[26-27]。對種子活力高低差異明顯的兩組小麥品種進行了GA3和ABA的含量測定，發(fā)芽率高的品種中GA3/ABA明顯高于發(fā)芽率低的品種，其中豫麥18的發(fā)芽率最高，GA3/ABA值也相應最高。

綜上，本試驗研究了不同小麥品種(系)在自然老化6年后的活力差異及與相關指標的相關性，試圖對種子活力差異的內在生理原因進行探究，發(fā)現(xiàn)不同品種間的種子活力存在較大變異，這為品種遺傳改良提供了可能。種子的休眠、萌發(fā)和種子活力的維持是一個相互關聯(lián)的、極其復雜的生理生化過程，要真正了解種子活力的本質，必須從激素調控、核酸修復、代謝水平和環(huán)境影響等各方面進行系統(tǒng)研究。目前關于種子活力的調控機理還有待進一步研究，了解和理解控制其復雜機制將具有非常重要的生態(tài)、農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟意義。