楊 璐， 趙振杰， 霍麗花， 王光一， 金 蕊， 于乃彬，辛賽格， 高 翔,2， 趙萬春,2， 董 劍,2， 李曉燕,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心， 陜西 楊凌 712100)

陜西省小麥栽培歷史悠久，是我國優(yōu)質(zhì)小麥生產(chǎn)區(qū)，1949 年以來，已經(jīng)經(jīng)歷了7 次品種更換。研究籽粒硬度基因在陜西省歷次品種更換過程中的演變，對了解Pina和Pinb等位變異類型，解析籽粒硬度形成的分子機制，推動陜西省乃至全國的小麥品質(zhì)育種具有重要意義。本研究用NIR和SKCS方法測定陜西省歷代和當(dāng)代小麥品種(系)的籽粒硬度，分析其硬度類型與演變規(guī)律，并利用PCR方法對籽粒硬度基因Pina和Pinb的等位基因變異類型進行檢測，揭示陜西省小麥品種更新?lián)Q代中籽粒硬度的遺傳與等位基因變異特點，以期為小麥品種選育和推廣中對籽粒硬度的改良提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1小麥品種(系)

陜西省歷代主要小麥品種(系)170份，包括當(dāng)代品種(系)119份，6次大規(guī)模換代代表性品種51份，主要由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥品質(zhì)遺傳改良實驗室提供，材料詳情見表1、表2。

表1 主要代表材料基本信息

表2 歷代主要小麥品種(系)

品種(系)名稱矮豐3號西農(nóng)881武農(nóng)68西農(nóng)312長安5號長武C34-3陜7859西農(nóng)971陜448秦農(nóng)18小偃325西農(nóng)2208陜229螞蚱麥秦農(nóng)578武農(nóng)21西農(nóng)111陜農(nóng)138陜160碧螞1號西農(nóng)2178武農(nóng)882陜447西農(nóng)558陜354西農(nóng)269西農(nóng)245阿勃西農(nóng)20西麥2號早系陜253偃麥894西農(nóng)145西安837西農(nóng)6582011高陵陜715西農(nóng)528西農(nóng)402西農(nóng)822小偃269西農(nóng)846陜538西農(nóng)266小偃22小偃327西農(nóng)018農(nóng)大1108西農(nóng)2000農(nóng)科0901西安603西農(nóng)810西農(nóng)1013西農(nóng)508西農(nóng)9872西農(nóng)13西安1104西農(nóng)823小偃282西農(nóng)861咸168西農(nóng)975西農(nóng)102西農(nóng)9811西農(nóng)056大荔1號西安3122西農(nóng)5311西農(nóng)538-12西農(nóng)2002武農(nóng)6號臨渭227西農(nóng)928農(nóng)麥1號西農(nóng)521陜墾99陜雜二號西農(nóng)383小偃864西農(nóng)023西農(nóng)8727西農(nóng)501武豐三號武農(nóng)886武168小偃312西農(nóng)2611西農(nóng)213西農(nóng)805西抗199陜墾138西農(nóng)1018武農(nóng)132小偃216陜農(nóng)70西抗6001荔高6號陜農(nóng)56邢9160小偃504西農(nóng)185西農(nóng)837豐產(chǎn)3號西農(nóng)121西農(nóng)16小偃166陜943陜農(nóng)33秦農(nóng)161西農(nóng)294偃展4110西農(nóng)6028陜墾57武農(nóng)986陜9872西農(nóng)638西農(nóng)898西農(nóng)84G6陜墾224小偃270陜218-33武農(nóng)9號秦農(nóng)16西農(nóng)165西農(nóng)1121西安735西農(nóng)811秦農(nóng)26王老師96-106西農(nóng)7733西安366西農(nóng)2718西農(nóng)93102戶縣中麥1號西農(nóng)223西農(nóng)335西農(nóng)112西農(nóng)986陜農(nóng)981西農(nóng)529西農(nóng)1918西農(nóng)958西農(nóng)1326陜225西農(nóng)9718陜墾32陜農(nóng)51西農(nóng)1623西安979西農(nóng)246陜墾9740西農(nóng)122西農(nóng)1043西農(nóng)196西農(nóng)1829陜254陜麥536西安240秦農(nóng)29西農(nóng)1725西農(nóng)65西農(nóng)509西安2871西安141長武C18-1陜農(nóng)342西安158西農(nóng)9871武農(nóng)148小揠6號

1.1.2引 物

Pina和Pinb等位基因檢測所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。

表3Pina和Pinb等位基因檢測引物信息

標(biāo)記(基因)序列(5'-3')片段大小( bp)退火/℃變異類型Pina-D1b[1]AATACCACATGGTTCTAGATACTGGCAATACAAAG-GACCTCTAGATT77655Pinb-D1bPina-D1b[2]ATGAAGACCTTATTCCTCCTACTCATGCTCACAGCCGCT77655Pinb-D1bPina[3]CATCTATTCATCTCCACCTGCGTGACAGTTTATTAGCTAGTC52450Pinb[3]GAGCCTCAACCCATCTATTCA,CAAGGGTGATTTTATTCATAG59750

1.2 方 法

1.2.1硬度測定

籽粒硬度利用Perten 4100型單籽粒谷物特性測試儀與Perten DA 7250型連續(xù)光譜近紅外分析儀測定。

1.2.2基因組DNA的提取

小麥種子在培養(yǎng)皿中進行發(fā)芽，至3葉期，用CTAB法[4]提取DNA。

1.2.3硬度基因型鑒定

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體積25μL，含有10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)5μL，ddNTP Mixture混合物(各2.4 mmol·L-1)3.9μL，模板DNA(gDNA)2.5 ng，上游引物1(20μmol·L-1)1μL，下游引物2(20μmol·L-1)1μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.25μL，加滅菌去離子水至25μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后每個循環(huán)：95 ℃變性30 s，53 ℃復(fù)性30 s(不同引物復(fù)性溫度見表3)， 72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒硬度演變規(guī)律

170份陜西小麥品種(系)的籽粒平均硬度指數(shù)為80.27，其中51份歷代小麥品種籽粒平均硬度指數(shù)為67.71，硬度指數(shù)最高的品種是西農(nóng)2208，硬度指數(shù)最低的品種是矮豐3號；當(dāng)代品種(系)平均硬度指數(shù)為85.65，籽粒硬度指數(shù)最高的品種是西農(nóng)9718(為128)，硬度指數(shù)最低的品種是西農(nóng)246(為61)。陜西省歷代小麥品種硬度指數(shù)平均數(shù)呈先降后升趨勢，總體呈逐漸上升趨勢(表4)。

表4 陜西省小麥品種(系)籽粒硬度

類型硬度指數(shù) 品種數(shù)比例/% 歷史品種當(dāng)代品種總品種歷史品種當(dāng)代品種總品種硬質(zhì)>7020466639.2238.6638.82混合40～70317310460.7861.3461.18軟質(zhì)<40000000

170份陜西小麥品種(系)中硬質(zhì)麥66份，混合麥104份，軟質(zhì)麥0份，分別占比38.82%、61.18%，0。51份歷代小麥品種中硬質(zhì)麥20份，混合麥31份，軟質(zhì)麥0份，分別占比39.22%、60.78%、0。當(dāng)代小麥品種(系)119份，硬質(zhì)麥46份，混合麥73份，軟質(zhì)麥0份，占比分別為38.66%，61.34%，0(表4)。

2.2 籽粒硬質(zhì)基因變異

2.2.1Pina和Pinb基因檢測

Pina-D1b檢測：Ha位點是否存在缺失，產(chǎn)物擴增長度為776 bp即Pina-D1b類型，在非Pina-D1b等位類型中無該特異條帶擴增。西農(nóng)2611、西農(nóng)2208、西農(nóng)84G6、西農(nóng)65、陜229等5份品種(系)擴增出該特異條帶，陜229等21份當(dāng)代品種中擴增出該特異條帶(圖1、圖2)。

注：1為DL 2000；2為小偃6號；3為西農(nóng)2611；4為西農(nóng)85；5為陜225；6為西農(nóng)2208；7為DL 2000；8為陜160；9為陜354；10為陜229；11為西農(nóng)196。

注：1為DL 2000；2為陜農(nóng)70；3為西農(nóng)2718；4為小偃22；5為武農(nóng)9號。

Pinb-D1b變異類型檢測：Pinb基因46位點甘氨酸向絲氨酸的變化，產(chǎn)物擴增長度為250 bp，在非Pinb-D1b類型則無該特異條帶擴增。歷代品種螞蚱麥、碧螞4號、豐產(chǎn)3號等24份材料攜帶Pinb-D1b基因型，西農(nóng)822等45份當(dāng)代品種攜帶Pinb-D1b等位基因。

Pina、Pinb全長基因檢測：可擴出Pina全長為524 bp的產(chǎn)物，51份歷代品種均擴增出524 bp條帶，秦農(nóng)18等45份當(dāng)代品種擴增出來該特異條帶。Pinb全長597 bp，51份歷代品種中均擴增出597 bp條帶，秦農(nóng)18等45份當(dāng)代品種擴增出該特異條帶。

2.2.2Pina和Pinb等位基因變異

在170份陜西小麥品種(系)材料中，Pina-D1b變異類型26份，占比15.29%，Pinb-D1b變異類型71份，占比41.76%。在51份陜西省歷代小麥品種(系)中，硬質(zhì)麥39.22%，混合麥60.78%；硬質(zhì)麥和混合麥中Pina-D1b類型共計5份，所占比例為9.80%；Pinb-D1b變異類型共計24份所占比例47.06%；當(dāng)代材料品種(系)119份，硬質(zhì)麥38.66%，混合麥61.34%。硬質(zhì)麥和混合麥中Pina-D1b類型21份，所占比例為17.65%；Pinb-D1b變異類型47份，所占比例為39.50%；17份攜帶Pina基因，占14.29%；75份攜帶Pinb基因，占63.03%(表4)。當(dāng)代品種Pina和Pinb基因序列長度具有多態(tài)性(表5)。

表5 陜西省小麥品種(系)Pina和Pinb等位基因型

年代材料/份等位基因變異Pina-D1b類型/%Pinb-D1b類型/%Pina/%Pinb/%歷代519.8047.06100.0100.00當(dāng)代11917.6539.5014.263.03總計17015.2941.7640.074.12

3 討 論

3.1 陜西歷代小麥籽粒硬度演變

本研究中，陜西省歷代小麥品種(系)材料共計51份，硬質(zhì)麥占39.22%，混合麥占60.78%。119份當(dāng)代小麥品種(系)中，硬質(zhì)麥占38.66%，混合麥占61.34%。王晶等[5]研究了262份中國小麥微核心種質(zhì)(MCC)和1 228份中國小麥主栽品種及重要親本，發(fā)現(xiàn)北方地區(qū)硬質(zhì)小麥品種較多。張晶等研究表明，陜西省當(dāng)代小麥品種(系)硬質(zhì)麥、混合麥、軟質(zhì)麥比例分別為71.6%、6.5%和21.9%[6]，而本研究未發(fā)現(xiàn)軟質(zhì)麥，可能與收集的品種大多來源于關(guān)中地區(qū)有關(guān)。本研究的51份歷代品種(系)材料平均硬度雖然經(jīng)歷了一個由降到升的過程，但總體硬度水平都偏高。

3.2 Pina和Pinb等位基因變異

20世紀(jì)90年代開始，小麥品質(zhì)和產(chǎn)量同時受到育種專家的關(guān)注，育成的品種中Pinb-D1b比例變高，如陜225、西農(nóng)2611和小偃22等都屬于Pinb-D1b類型。研究表明，90年代初期山東選育的優(yōu)質(zhì)品種中硬質(zhì)麥占多數(shù)，且同時期在全國范圍內(nèi)大面積推廣的有揚麥158等Pinb-D1b硬質(zhì)小麥[7-9]。本研究利用分子標(biāo)記分析了籽粒硬度基因Pina和Pinb的等位變異類型及組成，發(fā)現(xiàn)陜西省歷代品種材料中硬質(zhì)麥和混合麥中硬度基因Pina-D1類型為9.80%；Pinb-D1b類型為47.06%；當(dāng)代小麥品種(系)中硬度基因Pina-D1b類型為17.65%；Pinb-D1b類型為39.50%；Pina基因所占比例為14.29%；Pinb基因所占比例為63.03%，研究結(jié)果可為陜西小麥品種選育和品種推廣提供數(shù)據(jù)支持。