龍治堅， 鄭 升， 陳小軍， 邵征績， 任 鵬， 徐 剛， 黎 青， 胡尚連

(1.西南科技大學竹類研究所， 四川 綿陽 621010；2.西南科技大學生命科學與工程學院， 四川 綿陽 621010；3.四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所， 成都 610066)

竹亞科(Bambusoideae)是禾本科植物適應(yīng)森林生境的一個主要分支，與早熟禾亞科(Pooideae)和稻亞科(Oryzoideae)共同組成BOP支系[1]。竹亞科植物大部分種類存在木質(zhì)化，而且植株高大、生長迅速，但營養(yǎng)生長周期長達幾十年，甚至100多年[2]。我國擁有豐富的竹類資源，且對竹資源的研究、開發(fā)和利用均處于領(lǐng)先地位，素有“竹子王國”之美譽[2,3]。竹類植物開花后即成片死亡和營養(yǎng)生長周期的特殊生長習性給傳統(tǒng)的雜交育種帶來了諸多困難，影響了竹類植物新種質(zhì)的創(chuàng)制和培育，制約了竹的研究與應(yīng)用。和其他植物相比，竹類植物的育種和種質(zhì)創(chuàng)制嚴重滯后，而且主要集中在化學誘變和組培誘變上[4-7]，在物理誘變育種方面則相對較少[8]。這與我國研究竹、產(chǎn)竹、用竹的大國地位不相符合，有必要加大竹類新種質(zhì)創(chuàng)制與培育的力度。

輻射誘變是物理誘變育種的常用技術(shù)方法之一。該技術(shù)因其變異頻率高、變異譜大、可穩(wěn)定遺傳后代、育種年限短等特點而具有廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。其中，60Co-γ是輻射誘變常用的輻射源，具有穿透力強、突變率高等特點，易于使植物在分子、細胞和植株水平上發(fā)生變異[9]，已應(yīng)用于月季[9]、胡麻[12]、澳洲堅果[13]、洋紫荊[14]等植物，從而獲得有價值的新突變體，選育出一系列的優(yōu)良品種。鑒于此，本實驗以方竹種子為對象，研究不同60Co-γ劑量輻照下種子的萌發(fā)特性，以期探尋方竹種子的半致死輻照劑量，為竹類植物輻照誘變育種和新種質(zhì)創(chuàng)制提供可能的理論或經(jīng)驗借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019年4月，在四川省宜賓市興文縣仙鋒鄉(xiāng)(28°12′26″55 N，105°11′48″E)天然開花結(jié)實的方竹林里采集新鮮種子。種子采收后，裝入網(wǎng)袋，置于低溫箱內(nèi)迅速帶回四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所進行輻照處理。

1.2 方 法

1.2.1百粒重的測定

隨機選取100粒方竹種子，用萬分之一電子天平準確稱量百粒重，共3組。在每組中，隨機選取20粒種子，用游標卡尺精準測定方竹種子的長度和直徑，并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.2.2種子的輻照處理

選取顆粒飽滿、大小一致、發(fā)育良好的種子，在四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所的60Co-γ實驗室進行輻照處理。試驗設(shè)置6個水平：0 Gy(對照)、10 Gy、20 Gy、30 Gy、40 Gy和50 Gy，劑量率為1.40Gy·min-1。每個水平重復(fù)3次，每次100粒種子。

1.2.3種子的萌發(fā)與統(tǒng)計

每個60Co-γ處理水平進行3次重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。種子萌發(fā)在培養(yǎng)皿中進行，將種子放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿，加入10 mL蒸餾水；蓋上培養(yǎng)皿，用封口膜封好，置于25 ℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中進行試驗。每間隔48 h，適當給培養(yǎng)皿補充蒸餾水。光照/黑暗周期為12 h/12 h依次交替，光照強度為2 000 lx。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

每24 h統(tǒng)計種子的萌發(fā)情況。發(fā)芽率(%)、發(fā)芽勢(%)、相對發(fā)芽率(%)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等萌發(fā)特性指標檢測參照杜艷等[15,16]的方法。萌發(fā)結(jié)束后，測量幼苗的根長和芽長，并移栽到營養(yǎng)盤培養(yǎng)，統(tǒng)計成苗率。

1.2.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

利用Microsoft office Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，用Graph Pad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方竹的百粒重

采自于四川省宜賓市興文縣仙鋒鄉(xiāng)的方竹種子，百粒重為(17.279 3±1.923 4)g。種子的長度為(13.23±0.30)mm，寬度為(5.72±0.03)mm。

2.2 不同60Co-γ劑量輻照對方竹種子萌發(fā)特性的影響

60Co-γ輻照處理種子，可不同程度地影響種子的萌發(fā)進程和出苗的一致性[12]。結(jié)果(圖1)表明，在不同60Co-γ劑量輻照處理下，方竹種子的萌發(fā)進程受到了不同程度的抑制。在萌發(fā)試驗的第5天，對照組(ck)和低劑量處理組(10 Gy和20 Gy)的種子開始萌發(fā)，而高劑量處理組(30 Gy、40 Gy)和50 Gy處理的種子則分別在第8天和第11天開始萌發(fā)。同時，ck在第14天種子萌發(fā)結(jié)束，10 Gy和20 Gy的處理在第16天結(jié)束；高劑量處理40 Gy和50 Gy在第12天種子萌發(fā)結(jié)束。

圖1 不同60Co-γ劑量輻照下方竹種子萌發(fā)進程

種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的高低可反映種子生命活力的大小。不同60Co-γ劑量輻照后，方竹的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢受到了不同程度的抑制。當劑量為10 Gy時，發(fā)芽率為24.67%，發(fā)芽勢為22.00%，分別是ck(44.00%和38.00%)的0.561倍和0.579倍；當劑量為20 Gy時，種子的發(fā)芽率為10.67%，發(fā)芽勢為8.67%，分別是ck的0.242倍和0.228倍。這說明從發(fā)芽率和發(fā)芽勢的角度而言，方竹的60Co-γ輻照半致死劑量介于10～20 Gy之間。隨著輻照劑量的持續(xù)提高，各處理組的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均極顯著下降。當輻照劑量達到50 Gy時，種子的萌發(fā)率和發(fā)芽勢僅為2.67%和0.67%。同時，種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)可綜合反映種子的萌發(fā)情況與生長狀況，是判斷種子萌發(fā)能力的重要指標。結(jié)果(表1)表明，3個指標均隨著60Co-γ輻照劑量的增加而呈現(xiàn)降低的趨勢，且與對照組相比均極顯著降低。

表1 不同60Co-γ劑量輻照下方竹種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

劑量/Gy相對發(fā)芽率/%發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)ck100.000a2.575±0.136a25.492±1.391a1057.230±11.919b1.349±0.248b4.985±0.895b2024.717±4.866c0.509±0.042c1.321±0.275c3018.065±2.623d0.354±0.094d0.409±0.120d4010.939±3.433e0.214±0.046e0.181±0.039e506.042±1.929f0.105±0.039f0.019±0.004f

圖2 不同60Co-γ劑量輻照下方竹種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢

2.3 不同60Co-γ劑量輻照對方竹幼苗生長的影響

輻照脅迫對植物種子萌發(fā)芽長、根長的影響可以反映植物的早期抗逆性[10,17]。結(jié)果(圖3)表明，隨著輻照劑量的不斷提高，方竹幼苗的根和芽的生長受到了明顯的抑制，其根長和芽長極顯著降低。ck幼苗的根長為9.90 cm，芽長為4.85 cm。當輻照劑量為10 Gy時，幼苗的根長和芽長分別為3.70 cm和2.60 cm，比ck短了6.20 cm和2.25 cm。隨著劑量的繼續(xù)提升，根、芽也繼續(xù)變短。劑量為30 Gy時，根長只有1.15 cm，芽長為1.64；當劑量達到最高的50 Gy時，幼苗的生長受到嚴重的抑制，根和芽長度分別只有0.19 cm和0.33 cm(圖4)。

圖3 不同60Co-γ劑量輻照下方竹幼苗的根長和芽長

圖4 不同60Co-γ劑量輻照下方竹萌發(fā)后的幼苗

根冠比可反映植株在生長發(fā)育過程中受到逆境脅迫的程度。試驗發(fā)現(xiàn)，ck幼苗的根冠比為2.04；隨著輻照劑量的提高，處理組根冠比依次為1.42、1.51、0.70、0.94和0.58。根冠比隨著劑量的提高而呈下降的趨勢。當輻照劑量小于或等于20 Gy時，根冠比大于1.0，最小為1.51；而劑量大于等于30 Gy時，根冠比小于1.0；劑量為50 Gy時，根冠比僅為0.58。這表明高劑量嚴重抑制了根和芽的生長發(fā)育。實驗表明，ck組長出根和芽的幼苗，大部分都能正常生長，成苗率極高；而處理組除了10 Gy有5株正常生長外，其余處理組的幼苗均無法正常生長。這也表明方竹種子經(jīng)過輻照處理后，萌發(fā)的種子成苗率極低。這不僅和輻照有關(guān)，可能也與種子的質(zhì)量、幼苗的管理水平等有一定關(guān)系。

3 討 論

竹子的進化經(jīng)歷了漫長的過程，在約4 200萬年前開始分化形成草本竹和木本竹，最終形成不同的單系類群或多系類群的屬[2,18]。漫長的進化歷程使其適應(yīng)特殊的生長環(huán)境，形成營養(yǎng)周期長、結(jié)實率低的獨特生長發(fā)育習性，給雜交育種帶來了挑戰(zhàn)。輻照育種已應(yīng)用于澳洲堅果、瓜爾豆、洋紫荊、小麥等植物[13,14,19,20]，在竹類植物方面多集中在毛竹的應(yīng)用[21,22]。本研究結(jié)果表明，60Co-γ輻照處理不同程度地影響了方竹種子的萌發(fā)特性；隨著輻照劑量的提高，相較于ck，處理組方竹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等萌發(fā)特性指數(shù)均極顯著降低。這與李潔等[10]、蔡春菊等[22]的研究結(jié)果相類似，表明輻照處理影響了植物種子的萌發(fā)。同時，60Co-γ輻照處理使方竹種子的萌發(fā)起始日期推遲，并且提前結(jié)束萌發(fā)；尤其是高劑量處理推遲了4～5 d，卻提前2～3 d結(jié)束萌發(fā)。趙東曉等研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ輻照延遲了胡麻種子的萌發(fā)起始日期[12]；蔡春菊等[22]利用60Co-γ輻照毛竹種子，處理組的毛竹種子萌發(fā)進程也往后延遲。這可能是輻照后，種子內(nèi)部的自由基和酶活性發(fā)生變化，種胚組織受損，進而影響細胞的生長和分裂，萌發(fā)進程受阻[12]。

不同植物或同一植物的種子，因其遺傳背景、成熟度、含水量、內(nèi)含物、大小、種皮厚度等內(nèi)外因素的差異，導(dǎo)致對輻照劑量的承受有較大的差異[12]。在適度的范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的增加，材料的突變率、突變譜將會逐漸提高和拓寬；但超過臨界劑量后，隨著輻照劑量的繼續(xù)增加，材料的發(fā)芽率、成活率、成苗率將極大降低，而畸變率則增加[12,14]。洋紫荊種子60Co-γ輻照處理的劑量介于0～375 Gy之間，致死劑量為375 Gy[14]；胡麻的介于0～12 000 Gy之間，但半致死劑量為5 716～6 668 Gy[12]；烏拉爾甘草的介于0～300 Gy之間[17]；澳洲堅果的介于0～200 Gy之間[13]；而毛竹的輻照劑量則為0～400 Gy，臨界劑量和半致死劑量之間的范圍為100～175 Gy，這可作為毛竹種子誘變處理的最佳輻照劑量范圍[22]。本試驗的方竹種子，60Co-γ輻照處理劑量為0～50 Gy；當劑量為20 Gy時，方竹種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢急劇下降，分別為10.67%和8.67%，是ck的0.242倍和0.228倍；可見方竹的輻照半致死劑量應(yīng)該介于10～20 Gy之間。與上述不同科、屬植物相比，方竹種子耐輻照劑量范圍較窄；與同亞科的竹類植物毛竹相比較，其半致死劑量也相對極低。同時，輻照的劑量率也影響種子的萌發(fā)和成苗。鄭丹菁等研究不同劑量率和輻照時間對洋紫荊種子的萌發(fā)和幼苗生長發(fā)現(xiàn)，在同一輻照劑量水平下，隨著劑量率的提高，洋紫荊出苗率和成苗率均呈現(xiàn)下降的趨勢[14]。進一步比較發(fā)現(xiàn)，胡麻的劑量率為10 Gy·min-1，洋紫荊的劑量率為0.5、1.0、1.5、2.0 Gy·min-1，烏拉爾甘草的劑量率為2.67 Gy·min-1，毛竹的劑量率為1.90 Gy·min-1[12,13,17,22]，而本試驗的方竹劑量率為1.40 Gy·min-1。就理論上而言，本試驗處理方竹的輻照劑量低、劑量率小，其萌發(fā)率、成苗率、突變率等應(yīng)較為可觀，但結(jié)果表明，方竹沒有低劑量刺激效應(yīng)，且其成苗率極低(除了10 Gy處理可成苗外，其余處理的幼苗均不能正常生長)。張桂蓮等研究表明，水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、成苗率等特性與種子的成熟度呈正相關(guān)[23]；蘭科[24]植物、泡桐種子[25]也呈現(xiàn)類似的結(jié)果。而本試驗對照組的方竹種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別為44.00%、38.00%、2.575和25.492，某種程度上表明方竹種子的成熟度、含水量、內(nèi)含物均未達到最佳狀態(tài)。這可能導(dǎo)致方竹種子表現(xiàn)出對60Co-γ輻照極為敏感。

輻照誘變技術(shù)在新種質(zhì)資源創(chuàng)制、農(nóng)作物新品種培育等方面得到了廣泛的應(yīng)用[26]，也培育出一系列的優(yōu)異種質(zhì)資源，如低鎘積累的稻米品種，玉米、大豆、大麥等低值酸突變體[27,28]。輻射育種不僅為新品種同質(zhì)化嚴重、親本資源遺傳基礎(chǔ)狹窄問題提供了解決途徑, 也有望在解決育種工作中某些特殊問題方面取得突破[11]，如筍用竹、漿用竹、材用竹等功能型用竹的育種。本試驗初步研究筍用竹方竹對60Co-γ輻照的響應(yīng)，初步得到了低劑量的幼苗，這為從DNA、RNA及蛋白水平研究其誘變機制和分子標記輔助育種提供材料，也為后續(xù)漿用竹、材用竹的新種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。目前，國家加大了對誘變育種研究的支持力度，通過輻照誘變而培育出筍用竹、漿用竹、材用竹等功能型竹類植物新種質(zhì)和新品種，尤其是高纖維素、低木質(zhì)素的筍漿兩用竹，不僅可滿足生產(chǎn)對原材料的需要，還可減排降耗，推動以竹代木、林紙一體化的建設(shè)。