王椏楠， 茹 剛， 武國凡

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

雞爪大黃(原變種)又名唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Regel)，為蓼科大黃屬多年生高大草本植物，生于海拔2 500～3 500 m高山溝谷或林下，產(chǎn)于甘肅、青海及西藏一帶，其根狀莖及根內(nèi)含大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等[1]，可供藥用，具有攻積導(dǎo)滯、瀉火解毒、涼血止血的功效。目前對雞爪大黃的研究主要集中在其化學(xué)成分、存在部位及藥理作用分析，章英才等研究了六盤山雞爪大黃根和根莖醌類化合物的存在部位，結(jié)果表明，蒽醌婁化合物存在于根和根莖中，維管射線是其貯藏和積累的主要組織[2]；他們還研究了多糖的貯藏分布特征，結(jié)果表明，雞爪大黃多糖主要分布在根莖中，且薄壁細(xì)胞是其貯藏和積累的主要部位[3]。另外，趙建軍等[4]總結(jié)了甘南高寒冷區(qū)雞爪大黃栽培技術(shù)，播種前將種子在18～20 ℃的溫水中浸種 6～8 h并施加氮、磷、鉀含量各10%的復(fù)合肥可提高雞爪大黃產(chǎn)量。

近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，由工業(yè)和農(nóng)業(yè)所產(chǎn)生的各種重金屬經(jīng)河流排放而導(dǎo)致土壤污染日益劇增，據(jù)統(tǒng)計，我國約有2 000萬hm2的耕地面積受到了不同類別和不同程度的污染，大約占耕地面積的1/5[5]。不論是農(nóng)作物種植還是藥材種植都會通過食物鏈富集對人體造成重大的傷害。在藥材種植業(yè)中，中國大黃馳名中外，在西部，大黃主要分為2個品種，其1個是掌葉大黃，另一個是它的變種俗稱雞爪大黃，雞爪大黃的栽培相對比較廣泛，但栽培的雞爪大黃受超標(biāo)重金屬Pb2+的脅迫。本研究以甘肅省河西走廊中部的金昌市金川河兩岸為研究地點(diǎn)，該區(qū)域重金屬鉛(Pb)、銅(Cu)、汞(Hg)、鋅(Zn)等含量分布可高達(dá)654、3 756、359、442 mg·kg-1，重金屬Pb2+含量明顯超標(biāo)[6]。因此如何減小重金屬Pb2+對雞爪大黃的脅迫程度迫在眉睫。

NO作為信號分子可抵御重金屬污染，如劉柿良研究表明，對白車軸草施加適宜濃度外源NO能有效地緩解重金屬脅迫而造成的毒害，其機(jī)理是通過降低氧化損傷，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)NO的重新合成，再次確立ATP活性水平及使得因脅迫引起的相關(guān)激素含量再次達(dá)到平衡[6]。王逸筠等研究表明，外源NO可緩解Cu、Cd對番茄的脅迫[8]。景媛媛等研究表明，低濃度的外源NO供體硝普鈉SNP可緩解干旱脅迫對扁蓿豆(Medicagoruthenica)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，提高了扁蓿豆種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率和發(fā)芽勢[9]。

目前，外源NO處理能否有效緩解重金屬Pb2+脅迫對雞爪大黃種子萌發(fā)和幼苗的正常生長未見報道，本研究以雞爪大黃種子和幼苗為材料，探討了外源NO如何調(diào)節(jié)重金屬Pb2+脅迫下抗氧化酶活性的變化，以及對雞爪大黃幼苗膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有何影響，以期豐富重金屬Pb2+脅迫下外源NO通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性及細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來緩解逆境脅迫因子對藥用植物生理學(xué)代謝的迫害作用，拓展外源NO提高雞爪大黃幼苗抗逆性的應(yīng)用研究。

1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用雞爪大黃種子(由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院武國凡副教授鑒定為雞爪大黃)于2018年10月份采自甘肅省平?jīng)鍪辛P山(106°22′48″N，37°52′36″E)，氯化鉛(PbCl2)及外源NO供體SNP購自天津市北辰方正試劑廠。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1) 選取大小均勻、飽滿干燥的雞爪大黃種子50粒，然后用2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，再用清水沖洗5次，以蒸餾水為對照，用50、150、300、600、1 200 mg·L-1的PbCl2溶液浸種24 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。浸種處理完成后，將種子置于9 cm墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，在SPX-150-GB型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)(溫度：20 ℃，光周期：12 h黑暗/12 h光照，光強(qiáng)：4 000 lx，濕度：50%)直到第1粒種子萌發(fā)，以芽長為種子長度的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。每天統(tǒng)計發(fā)芽率，測量根長并計算發(fā)芽勢、活力指數(shù)。

2) 參照以上方法用蒸餾水培養(yǎng)7組雞爪大黃幼苗，待幼苗的2片子葉完全伸展開后，1組葉面噴施蒸餾水作為未脅迫對照，剩余6組葉面噴施600 mg·L-1PbCl2溶液進(jìn)行處理，5 d后對這6組處理分別施加濃度為0、50、100、200、500、1 000μmol·L-1的外源NO供體硝普鈉溶液進(jìn)行緩解(每天噴施相應(yīng)濃度SNP溶液，確保幼苗葉片濕潤即可)。待5 d后測定MDA、Pro、葉綠素(a+b)含量、REC、SOD、POD活性。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

MDA含量測定參照劉家堯等[10]的硫代巴比妥酸法；Pro含量的測定采用茚三酮比色法[11]；葉綠素(a+b)含量的測定按照Arnon[12]的方法；REC的測定參照王學(xué)奎[13]的方法；SOD活性參照李合生[14]的方法，POD活性使用愈創(chuàng)木酚測定法[14]。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，使用Origin 8.50軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度的PbCl2溶液對雞爪大黃種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

以蒸餾水為對照，使用不同濃度PbCl2溶液浸種處理雞爪大黃種子24 h。隨著處理溶液濃度的增大，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)整體呈下降趨勢(圖1)。當(dāng)PbCl2溶液濃度小于150 mg·L-1時，浸種處理對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢較對照組沒有顯著性差異(p>0.05)，而活力指數(shù)較對照組顯著下降，說明幼苗根長顯著受到抑制作用，即幼苗對PbCl2溶液脅迫相對種子較為敏感。當(dāng)PbCl2溶液濃度大于150 mg·L-1時，隨著處理溶液濃度的增大，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)連續(xù)下降，當(dāng)PbCl2溶液處理濃度為1 200 mg·L-1時完全抑制雞爪大黃種子的萌發(fā)。表明高濃度的PbCl2溶液對雞爪大黃種子萌發(fā)及幼苗的生長具有很強(qiáng)的抑制作用。

圖1 不同濃度的PbCl2溶液對雞爪大黃種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)的影響

3.2 外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗生理特性的影響

3.2.1不同濃度的外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗MDA含量的影響

選擇未受到脅迫的一組雞爪大黃幼苗作為第1個對照(ck0)，600 mg·L-1PbCl2溶液脅迫而未進(jìn)行緩解的雞爪大黃幼苗作為第2個對照(ck1)。ck1較ck0MDA含量顯著上升(p<0.05)，但隨著SNP溶液處理濃度的提高，MDA含量先降低后升高(圖2)。SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，雞爪大黃幼苗體內(nèi)MDA含量降到最低，較ck1降低了50.40%，與ck0相比，MDA含量無顯著性差異(p>0.05)。此后，隨著SNP溶液處理濃度的繼續(xù)提高，雞爪大黃幼苗體內(nèi)MDA含量又逐漸上升，當(dāng)SNP溶液處理濃度達(dá)到1 000μmol·L-1時，MDA含量顯著高于其他各處理組(p<0.05)。

圖2 SNP溶液對MDA含量的影響

3.2.2不同濃度的外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗體內(nèi)SOD、POD活性的影響

(2) 由軸箱彈簧引起的偏差ΔB1與ΔB2。根據(jù)彈簧串聯(lián)定律可知，將一個剛度為K、原長為L1的彈簧與一個剛度無窮大、原長為L2的彈簧串聯(lián)，串聯(lián)后的彈簧剛度為K，原長為L1+L2。因此，在軸箱彈簧處加設(shè)墊片，等效于改變軸箱彈簧的原長。因此，這部分偏差可通過在軸箱彈簧處加設(shè)墊片來減小。

1) 幼苗體內(nèi)SOD活性的變化。

未受到PbCl2溶液脅迫的ck0組雞爪大黃幼苗體內(nèi)SOD活性相對較低，幼苗遭受PbCl2溶液脅迫的ck1組SOD活性較ck0組顯著升高(p<0.05)。對雞爪大黃幼苗施加不同濃度的SNP溶液進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)隨著SNP溶液處理濃度的增大，雞爪大黃幼苗體內(nèi)SOD活性先升高后降低(圖3)。當(dāng)SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，SOD活性達(dá)到峰值，較ck1提高了60.98%(p<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200μmol·L-1，隨著溶液濃度的提高SOD活性逐漸下降。表明適宜濃度的外源NO可提高植物體內(nèi)SOD的活性，從而可消除植物體內(nèi)積累過多的活性氧(ROS)。

圖3 SNP溶液對SOD活性的影響

2) 幼苗體內(nèi)POD活性的變化。

雞爪大黃幼苗遭受PbCl2溶液脅迫后，未施加SNP溶液緩解的ck1組較未受到PbCl2溶液脅迫的ck0組幼苗體內(nèi)POD活性略微降低但不顯著(p>0.05)。當(dāng)對雞爪大黃幼苗施加不同濃度的SNP溶液進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)隨著SNP溶液處理濃度的增大，雞爪大黃幼苗體內(nèi)POD活性先升高后降低(圖4)。當(dāng)SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，POD活性達(dá)到峰值，較脅迫而未受到SNP溶液緩解的ck1組提高了454.87%(p<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200μmol·L-1時，隨著溶液濃度的提高POD活性逐漸下降。表明適宜濃度的外源NO可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)在逆境條件下POD的活性，從而消除植物體內(nèi)積累過多的H2O2等有毒物質(zhì)。

圖4 SNP溶液對POD活性的影響

3.2.3不同濃度的外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗葉綠素(a+b)含量的影響

PbCl2溶液脅迫后未施加SNP溶液緩解的ck1組幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量較未受到脅迫的ck0組幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量顯著下降(p<0.05)。對PbCl2溶液脅迫后的幼苗施加不同濃度的SNP溶液，發(fā)現(xiàn)隨著SNP溶液處理濃度的提高，幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量先升高后降低(圖5)。在SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，葉綠素(a+b)含量較其它各處理組顯著提高，較脅迫而未緩解的ck0組葉綠素(a+b)含量提高了86.00%(p<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200μmol·L-1時，雞爪大黃幼苗體內(nèi)葉綠素含量又逐漸下降，可能是由于高濃度的NO分子的毒性作用抑制了葉綠素的合成。

圖5 SNP溶液對葉綠素(a+b)含量的影響

3.2.4不同濃度的外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗Pro含量的影響

未受到脅迫的ck0組幼苗體內(nèi)Pro含量相對較低，遭受PbCl2溶液脅迫后的ck1組Pro含量顯著上升(p<0.05)。對PbCl2溶液脅迫后的幼苗施加不同濃度的SNP溶液，發(fā)現(xiàn)隨著SNP溶液處理濃度的提高，幼苗體內(nèi)Pro含量先升高后降低(圖6)。在SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，Pro含量較其它各處理組顯著提高，較脅迫而未緩解的ck1組Pro含量提高了341.97%(p<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200μmol·L-1時，雞爪大黃幼苗體內(nèi)Pro含量又逐漸下降。表明適宜濃度的外源NO可通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸的含量來維持細(xì)胞與環(huán)境間的滲透平衡。

圖6 SNP溶液對脯氨酸含量的影響

3.2.5不同濃度的外源NO對PbCl2溶液脅迫下幼苗REC的影響

未受到PbCl2溶液脅迫的ck0組幼苗REC較低，當(dāng)遭受PbCl2溶液脅迫后的ck1組幼苗REC顯著性上升(p<0.05)。對PbCl2溶液脅迫后的幼苗施加不同濃度的SNP溶液，發(fā)現(xiàn)隨著SNP溶液處理濃度的提高，幼苗REC先降低后升高(圖7)。在SNP溶液處理濃度為200μmol·L-1時，幼苗REC較其它各處理組顯著降低，較脅迫而未緩解的ck1組REC降低了65.22%(p<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200μmol·L-1時，雞爪大黃幼苗REC又逐漸下降。表明適宜濃度的外源NO可緩解重金屬脅迫對細(xì)胞膜的破壞，從而減少了細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)物質(zhì)大量外滲。

圖7 SNP溶液對電導(dǎo)率的影響

4 討論與結(jié)論

植物在生長發(fā)育過程中會遭受不同類型的生物脅迫，如干旱、洪災(zāi)、高溫、凍害、鹽度、重金屬污染等，于是植物在漫長的進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜的預(yù)防機(jī)制來應(yīng)對不良環(huán)境對其造成的傷害[15]。但是當(dāng)生物脅迫超過植物的一定耐受范圍就會導(dǎo)致植物的死亡。種子萌發(fā)是植物生活史的起點(diǎn)，也是植物感知外界環(huán)境條件最初生命階段，對重金屬污染最為敏感。很多研究報道，重金屬脅迫對植物的種子萌發(fā)及幼苗生長具有不同的影響，重金屬脅迫主要通過抑制植物細(xì)胞的分裂和伸長，進(jìn)而激活或者抑制某些酶的活性，從而阻止蛋白質(zhì)的合成，最終影響植物的呼吸作用和光合作用等生理代謝過程[16]。王丹等[17]報道高濃度的(>200 mg·kg-1)Cu對白菜幼苗的生長具有抑制作用，且隨著Cu濃度的不斷增大抑制作用逐漸增強(qiáng)。Zn對田箐幼苗進(jìn)行脅迫后與對照組相比其生長量顯著減少了25.2%[18]。

該實(shí)驗(yàn)首先使用不同濃度(0、50、150、300、600、1 200 mg·L-1)的PbCl2溶液對雞爪大黃浸種(24 h)進(jìn)行培養(yǎng)萌發(fā)，測試重金屬鉛對雞爪大黃的抑制效應(yīng)，結(jié)果表明：隨著PbCl2溶液處理濃度的增大，雞爪大黃種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)均不同程度地下降，最后完全抑制雞爪大黃種子的萌發(fā)。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，過低濃度的PbCl2溶液處理雞爪大黃幼苗后各項生理指標(biāo)較對照組無顯著性差異(p>0.05)，而過高濃度的PbCl2溶液處理使得雞爪大黃幼苗葉片腐爛甚至出現(xiàn)死苗現(xiàn)象，故而該實(shí)驗(yàn)選擇中間濃度為600 mg·L-1的PbCl2溶液對雞爪大黃幼苗進(jìn)行脅迫處理，既能保證幼苗的存活又可體現(xiàn)出各項生理指標(biāo)較對照組的顯著變化，從而通過施加外源NO來判斷是否對幼苗的各項生理指標(biāo)起到明顯的緩解作用。

MDA是由O2·-引發(fā)的膜脂過氧化最終產(chǎn)物，該實(shí)驗(yàn)雞爪大黃幼苗遭受PbCl2溶液脅迫后MDA含量大量積累，最佳濃度(200μmol·L-1)SNP溶液處理雞爪大黃幼苗不僅減少了MDA的生成，并且提高了SOD、POD的活性，其機(jī)理是適宜濃度的外源NO中斷了ROS誘發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及誘導(dǎo)抗氧化酶活性的升高，減弱了ROS的氧化損傷來避免細(xì)胞中不飽和脂肪酸的雙鍵被氧化，從而減少了MDA的生成[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與趙奕翔[20]的研究結(jié)果相吻合，趙奕翔探究了外源NO對鹽脅迫下玉竹光合作用及抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明：外施NO可以提高玉竹幼苗體內(nèi)抗氧化保護(hù)酶的活性，降低了MDA含量，提高了抗氧化保護(hù)酶的活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量。幼苗受到脅迫后植物體內(nèi)SOD活性升高是為了清除脅迫產(chǎn)生的超氧自由基，SOD通過催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，H2O2進(jìn)一步被POD和CAT清除，這也是植物在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一種自我保護(hù)的本能。與此同時，經(jīng)200μmol·L-1SNP溶液緩解幼苗后發(fā)現(xiàn)，葉綠素(a+b)含量、Pro含量顯著增加，REC顯著降低，這與Yu等[21]的研究結(jié)果吻合，表明適宜濃度的外源NO增強(qiáng)了幼苗在逆境脅迫下葉綠素的合成，提高了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro的含量。Pro作為可溶性物質(zhì)是植物體內(nèi)組成蛋白質(zhì)的主要成分之一，以游離的狀態(tài)廣泛存在于植物體內(nèi)，因此植物可以通過累積Pro的含量來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡。REC顯著降低意味著細(xì)胞膜得到了有效的保護(hù)，避免大量可溶性物質(zhì)及導(dǎo)電性離子外滲。

結(jié)論：最佳濃度(200μmol·L-1) SNP溶液可提高雞爪大黃幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性，增強(qiáng)幼苗ROS清除能力，降低細(xì)胞膜過氧化程度，增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，進(jìn)而抵御重金屬Pb2+對藥用植物雞爪大黃幼苗的毒害。從而減少重金屬Pb2+在藥材中的富集量，達(dá)到增加藥材產(chǎn)量、優(yōu)化藥材品質(zhì)、提高農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的目的。