李榮田， 孟德鑫， 蘇 迪， 王夢露， 劉長華,3

(1.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室， 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心， 哈爾濱 150500；3.黑龍江大學農業(yè)資源與環(huán)境學院， 哈爾濱 150080)

中國是世界上最大的水稻(OryzasativaL.)生產國與消費國[1]。黑龍江省是中國粳稻生產第一大省，是世界水稻栽培北限。黑龍江生產的稻米大部分進入國際國內市場，寒區(qū)稻米以其綠色優(yōu)質特征深受消費者青睞[2-4]。早粳稻品種空育131具有豐產性好、耐冷性強、穩(wěn)產、米質較好等特征，曾經連續(xù)多年是我國北方粳稻種植面積最大的品種，目前在黑龍江省北部水稻主產區(qū)仍然是生產上使用的品種之一。以水稻空育131為“底盤”，改良其抗稻瘟病性及食味米質特征，可以延長優(yōu)良“老品種”利用年限。空育131系非香味水稻，創(chuàng)制香米版的空育131及利用香米版的空育131有利于寒區(qū)稻米食味品質的提升[5-6]。水稻香米性狀有或無的主效基因Fgr/fgr(BADH2)位于第8號連鎖群的RG 28/Y 5與RG 1之間。野生型Fgr編碼甜菜堿醛脫氫酶(BADH2)，在非香水稻品種中，BADH 2蛋白催化4-氨基丁醛氧化成甜菜堿[7]，而4-氨基丁醛是水稻香味主要成分2-乙?；?1-吡咯啉(2-AP)的合成前體[8]，當4-氨基丁醛被BADH 2氧化后2-AP合成受到抑制，水稻沒有香味。如果Fgr基因發(fā)生功能性突變，導致BADH 2蛋白喪失功能，不能催化4-氨基丁醛的氧化，4-氨基丁醛積累促進了2-AP的合成，使水稻產生香味[9]。對香稻和非香稻品種進行比較測序發(fā)現，Fgr基因在不同的水稻品種中存在多種類型的突變[10]。在香稻品種中, 常見的是Fgr基因的第7外顯子有1個8 bp的缺失和3個單核苷酸多態(tài)性位點[11]。利用分子標記輔助選擇(MAS，marker-assisted selection)技術，通過回交育種可以快速、準確地創(chuàng)制水稻目標基因導入系[12-14]。Chen等[15]利用與目標基因緊密連鎖的分子標記進行正向前景選擇，利用多個RFLP標記進行負向背景選擇，回交轉育把廣譜抗白葉枯病基因Xa21導入明恢63水稻恢復系，明恢63(Xa21)與明恢63比較，抗白葉枯病抗性強、其他性狀沒有顯著差異。Khanna等[16]以水稻Basmati為受體品種，利用MAS技術回交轉育成功地創(chuàng)制了7個主效抗稻瘟病基因的近等基因系。Yang等[17]利用MAS結合SNP芯片全基因組掃描，多次回交把抗稻瘟病基因Pi2導入光溫敏核不育系Feng 39 S，改進了Feng 39不育系及其衍生雜交種的抗稻瘟病性。進行全基因組背景選擇還可以改良水稻產量等數量性狀。Feng等[18]和Nan等[19]替換了水稻空育131一段含有GS3和Gnla基因的染色體片段，重構了基因組的空育131產量顯著增加。MAS技術結合回交轉育用于水稻質量性狀及主效QTL控制性狀遺傳改良是十分有效的。黑龍江省香稻品種主要是以稻花香2號、綏粳4號為親本育成的品種[20]。與綏粳4號水稻的濃香比較，稻花香2號及其衍生的香稻品種的清香更受市場歡迎。為了使早粳稻空育131具有稻花香2號一樣的香味性狀，有必要培育具有稻花香2號香味基因的空育131。通過回交轉育，利用MAS技術結合農藝性狀檢測鑒定，將稻花香2號香味基因導入早粳稻空育131中，選育出與空育131農藝性狀相同且具有香味的空育131(fgr)導入系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1水 稻

受體親本：早粳稻品種空育131，具有耐冷、早熟、產量高而穩(wěn)定、加工品質良好等性狀，為黑龍江省主栽品種。

供體親本：具有香味性狀的稻花香2號水稻。

受體親本與供體親本雜交、回交及自交等世代育種材料，以及新創(chuàng)制的早粳稻空育131(fgr)導入系。

1.1.2前景選擇候選SNP標記

香味基因fgr定位在第8號染色體上，香味基因fgr對非香味基因Fgr為隱性。通常情況下野生型Fgr基因與突變型fgr基因比較，Fgr在甜菜堿醛脫氫酶的編碼區(qū)中發(fā)生了8個bp的缺失和3 bp的替換[5]，根據這一特點設計了4條引物的SNP-fgr標記(見圖1)[21]，擬作為創(chuàng)制空育131(fgr)導入系的前景選擇標記。SNP-fgr標記PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

注：…表示省略的堿基;小寫字母表示替換的堿基;底紋字母表示缺失的堿基;下劃線字母表示PCR引物。

1.1.3背景選擇候選SSR標記

本研究從水稻12條連鎖群上均勻選取48個SSR分子標記和NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法》中用于水稻品種指紋圖譜鑒定分析的48個SSR標記，共96個SSR作為背景選擇候選標記(見表1)。表1中SSR標記引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

實驗及試驗中所用的分子生物學試劑及化學試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 創(chuàng)制早粳稻空育131(fgr)導入系背景選擇候選SSR

連鎖群SSR標記Chr.1RM583RM1195RM493RM443RM6464RM1010RM10027RM10397Chr.2RM71RM208RM561RM490RM12322RM12510RM3680RM3601Chr.3RM85RM232RM8277RM424RM7332RM14280RM14402RM15416Chr.4RM471RM119RM551RM423RM16304RM1236RM16876RM16993Chr.5RM274RM267RM598RM571RM3683RM18236RM7449RM18612Chr.6RM190RM253RM176RM231RM204RM19642RM20049RM3207Chr.7RM336RM481RM432RM567RM6652RM20856RM21153RM21511Chr.8RM72RM339RM331RM289RM8020RM22508RM23098RM23511Chr.9RM219RM278OSR28RM542RM24190RM24117RM24837RM24846Chr.10RM311RM258RM590RM316RM25139RM25811RM25200RM25510Chr.11RM209RM224RM21RM332RM26509RM3225RM26604RM26924Chr.12RM190RM17RM3331RM7102RM27430RM27537RM27548RM28765

注：下劃線SSR表示包含于《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法》(NY/T 1433-2014)的SSR。下同。

1.2.1水稻基因組DNA提取與PCR擴增

采用寇姝燕等[22]的方法(略作改動)提取水稻全基因組DNA，將提取后的DNA存放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SNP-fgr標記PCR體系20μL：10μmol·L-1P10.5μL，10μmol·L-1P20.5μL，10μmol·L-1P30.5μL，10μmol·L-1P40.5μL，水稻模板DNA 2μL，TaqPCR Master Mix(0.1 U·μL-1TaqDNA Polymerase，2×PCR buffer，3 mmol·L-1MgCl2，0.4 mmol·L-1dNTP)10μL，ddH2O 6μL。

SNP-fgr標記 PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復性30 s，72 ℃引物延伸30 s，30個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min；4 ℃ ∞。

SSR標記PCR體系10μL：10μmol·L-1正向引物 0.5μL，10μmol·L-1反向引物 0.5μL，水稻模板DNA 1μL，Mix(0.1 U·μL-1TaqDNA Polymerase，2×PCR buffer，3 mmol·L-1MgCl2，0.4 mmol·L-1dNTP)3μL，ddH2O 5μL。

SSR標記PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復性30 s，72 ℃引物延伸30 s，30個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min；4 ℃ ∞。

利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測。

1.2.2水稻空育131(fgr)導入系的培育過程

創(chuàng)制及培育水稻香味空育131(fgr)導入系的培育過程見圖2。

圖2 創(chuàng)制及培育香味空育131(fgr)導入系的過程

注：M表示Maker D;1～5表示稻花香2號;6～10表示空育131;B表示ddH2O。

表2 創(chuàng)制及培育水稻空育131(fgr)導入系背景選擇SSR標記

連鎖群SSR標記Chr.1RM1195RM10010Chr.2RM71RM12510RM3680Chr.3RM232RM7332RM14402Chr.4RM551RM16304RM1236RM16876RM16993Chr.5RM598RM3683Chr.6RM190RM253Chr.7RM432RM6652RM21153Chr.8RM72RM339RM8020Chr.9RM278RM24190RM24117RM24837Chr.10RM590RM25139RM25811Chr.11RM332RM26509Chr.12RM17RM27430

1.2.3候選水稻空育131(fgr)導入系田間農藝性狀調查

候選空育131(fgr)導入系及空育131(ck)進行田間試驗，試驗設計為隨機區(qū)組法，3次重復。小區(qū)4行區(qū)，行長5 m，插秧規(guī)格行距30 cm、株距12 cm，每篼插3～4棵苗，小區(qū)面積6 m2。育苗及田間管理與當地生產田相同。調查生育期、整齊度、株高、穗數、穗長、穗粒數、結實率、千粒重、穗重及產量等性狀。以小區(qū)平均數為基礎數據進行統(tǒng)計分析。

1.2.4水稻空育131(fgr)導入系耐冷性、稻瘟病抗性和抗倒伏性鑒定

耐冷性鑒定。按照李霞等[23]的方法對空育131(fgr)導入系及空育131水稻進行耐冷性鑒定。待水稻花粉母細胞減數分裂期時將一部分水稻材料放置在溫室，另一部分水稻材料移至人工氣候箱中進行15 ℃低溫脅迫處理。低溫脅迫5 d后移至溫室直到水稻成熟。分別計算常溫和低溫脅迫下的孕穗期結實率，重復5次取其平均值。

抗稻瘟病性鑒定。根據農業(yè)行業(yè)標準《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規(guī)程》(NY/T 2646-2014)對空育131(fgr)導入系及空育131水稻進行抗稻瘟病性鑒定。水稻材料種植在稻瘟病鑒定圃，多施氮肥，周邊種植感病品種蒙古稻。在水稻分蘗期和孕穗初期時接種當地混合稻瘟病菌，孢子濃度為2×105個·mL-1，15 d后調查水稻葉瘟及穗頸瘟級別。每個水稻材料取5株調查，取其平均值。

抗倒伏性鑒定。在空育131(fgr)導入系及空育131水稻抽穗20 d左右時，根據Yang等[17]的方法調查水稻材料基部第2節(jié)間的彎曲力矩、抗折力及倒伏指數。彎曲力矩=基部第2節(jié)間底部至穗頂的長度(cm)×基部第2節(jié)間底部到穗頂鮮重(g)?？拐哿y定，將帶有葉鞘的基部第2節(jié)間兩端橫亙在2個支點上，保持水稻材料水平，在待測水稻節(jié)間中點處懸掛一個盤子，并向盤子中加入重物，直到水稻莖稈折斷時為止，此時盤子及重物的合計重量就是該節(jié)間莖稈的抗折力。倒伏指數=彎曲力矩/抗折力×100。每個水稻材料測量5次倒伏指數，取其平均值代表抗倒伏性。

1.2.5水稻空育131(fgr)導入系稻米香味性狀檢測 水稻導入系空育131(fgr)和空育131收獲3個月后，按空育131(fgr)∶空育131為0∶20、4∶16、8∶12、12∶8、16∶4和20∶0的比例取20粒精米放入玻璃瓶中，再把10 mL左右的1.7%氫氧化鉀溶液加入瓶中，蓋上瓶蓋，室溫下保持10 min后，開啟瓶蓋，選擇10位對氣味敏感的人員獨立嗅瓶中的氣味，記作香或非香兩類，每種比例的精米重復3次。

2 結果與分析

2.1 前景及背景選擇分子標記體系

2.1.1前景選擇標記

SNP-fgr標記對水稻空育131與稻花香2號的PCR檢測結果見圖3。圖3顯示，SNP-fgr標記在空育131和稻花香2號水稻之間有明顯的多態(tài)性，說明稻花香2號香味性狀基因位點與多數香米品種突變序列相同，可以用SNP-fgr標記選擇稻花香2號香味基因fgr。

2.1.2背景選擇標記

從96個候選的背景選擇SSR標記中篩選出了在水稻空育131和稻花香2號之間具有穩(wěn)定的、多態(tài)性顯著的34個SSR標記，作為創(chuàng)制及培育空育131(fgr)導入系各回交世代及自交世代植株進行背景選擇的分子標記(見表2)。

注：M表示Maker D;K表示空育131;D表示稻花香2號;1～19表示F1代植株;B表示ddH2O。

注：M表示Maker D;K表示空育131;D表示稻花香2號;1～22表示BC3F2代植株;B表示ddH2O。

注：M表示Maker D;K表示空育131;D表示稻花香2號;1～5表示空育131(fgr)-1;6～10表示空育131(fgr)-2;B表示ddH2O

表3 創(chuàng)制水稻空育131(fgr)導入系各回交世代鑒定選擇

世代總株數/株前景選擇的株數/株背景恢復率/%入選植株多態(tài)性的背景選擇SSR標記BC1F1492376.47～61.18RM232 RM551 RM16876 RM190 RM339 RM25811 RM332 BC2F1241397.06～82.35RM190 BC3F1107100.00～97.06

表4 候選水稻空育131(fgr)導入系田間農藝性狀

性狀空育131空育131(fgr)-1空育131(fgr)-2株高/cm83.80±1.3283.45±0.9283.56±0.86穗數/穗21.70±1.2521.53±1.5521.56±1.34穗長/cm14.62±0.7015.26±1.5815.03±1.38穗重/g28.14±1.2027.63±1.8327.93±1.66穗粒數/粒79.90±1.0580.21±0.7380.14±0.96結實率/%86.57±1.6586.52±0.9585.91±1.35千粒重/g26.84±0.9227.04±0.8826.89±1.28產量/(kg·m-2)0.90±0.050.90±0.150.89±0.12生育期/d126.00±1.00127.00±0.50127.00±1.00整齊度整齊整齊不整齊

2.2 水稻空育131(fgr)導入系的創(chuàng)制

2.2.1F1世代植株鑒定選擇

早粳稻空育131為母本、稻花香2號為父本進行雜交得到F1代。利用SNP-fgr標記對F1代植株進行鑒定(見圖4)，在19個F1代植株中1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、17、18、19號等16株表現出雜合帶型，說明含有fgr基因，是真雜種；其余植株表現出空育131帶型，不含有fgr基因，是偽雜種?？沼?31水稻為母本，含有fgr基因的F1植株作父本進行回交，獲得BC1F1世代植株。

2.2.2回交世代植株鑒定選擇

BC1F1世代的植株共有49株，含有fgr基因的植株為23株，其中背景恢復率最高為76.47%(見表3)。在BC1F1世代群體中選擇含有fgr基因、背景恢復率最高的植株作為父本，與空育131進行第2次回交獲得BC2F1群體(見表3)。在BC2F1世代進行與BC1F1世代相類似的鑒定、選擇及有性雜交工作，獲得了BC3F1世代(見表3)。在BC3F1世代群體中選擇出了7株攜帶fgr基因的植株，從中選擇了背景恢復率100%、外觀形態(tài)性狀與空育131水稻相同或相似程度高的單株自交并收獲種子，即BC3F2代群體。

2.2.3自交世代植株及株系鑒定選擇

利用SNP-fgr分子標記對空育131(fgr)BC3F2代植株進行前景鑒定選擇(見圖5)。在22個BC3F2代植株中1號和20號植株表現出稻花香2號帶型，說明第1號和第20號植株是fgr基因的純合體；2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、17、18、19、22號植株表現為雙親帶型，是Fgr/fgr基因的雜合體；其余植株表現出空育131帶型，不含有fgr基因。選擇fgr基因的純合體，令其自交獲得BC3F3代株系2個，即水稻空育131(fgr)-1和空育131(fgr)-2。

在水稻空育131(fgr)-1和空育131(fgr)-2株系中各隨機選取5株，利用SNP-fgr標記進行鑒定(見圖6)。圖6顯示，所有空育131(fgr)導入系植株都與稻花香2號基因型一致，說明水稻空育131(fgr)-1和空育131(fgr)-2株系為fgr基因純系。

2.3 候選的水稻空育131(fgr)導入系農藝性狀

對候選的水稻空育131(fgr)導入系進行農藝性狀調查并與空育131進行比較(見表4)，生育期、株高、穗數、穗長、穗重、穗粒數、結實率、千粒重及產量等性狀，空育131(fgr)-1、空育131(fgr)-2與對照空育131均不存在顯著性的差異。但是，空育131(fgr)-2田間整齊度較差，淘汰。選擇空育131(fgr)-1為空育131(fgr)導入系，進行進一步的鑒定。

圖 7 水稻空育131(fgr)導入系稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性

2.4 水稻空育131(fgr)導入系稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性

圖7顯示，空育131(fgr)導入系與空育131葉瘟發(fā)病級及穗頸瘟發(fā)病級不存在顯著性差異；在常溫狀態(tài)下及低溫脅迫時水稻空育131(fgr)與空育131結實率差異均不顯著；水稻空育131(fgr)導入系與空育131的倒伏指數也未見顯著性差異。所有這些說明，水稻空育131(fgr)導入系的稻瘟病抗性、耐冷性和抗倒伏性與空育131水稻相同。

2.5 水稻空育131(fgr)導入系稻米香味性狀

10位對氣味敏感的檢測人員對水稻空育131(fgr)導入系和空育131不同比例的精米樣品進行香味鑒定(見表5)。表5顯示，10個人對空育131均不能嗅到香味，而對水稻空育131(fgr)導入系均能嗅到香味，說明這10個人具有對稻米香味的判別能力。從表5還可知，空育131(fgr)導入系稻米比例為20%時有43.3%的人可以嗅到香味，比例為40%時有76.7%的人可以嗅到香味，比例超過60%時所有人均能嗅到香味。說明空育131(fgr)導入系的稻米具有香味性狀；在空育131稻米中加入空育131(fgr)導入系稻米的比例越大，香味越明顯。

表5 水稻空育131(fgr)導入系稻米香味性狀

處理空育131(fgr)∶空育131(精米粒數比)嗅到香味的人數ⅠⅡⅢ平均10∶200000.0024∶165444.3338∶128787.67412∶810101010.00516∶410101010.00620∶010101010.00

3 討論與結論

植物連續(xù)多代回交可以使非輪回親本細胞核被輪回親本細胞核所替換?；亟唤Y合對來自非輪回親本基因的選擇，可以創(chuàng)制具有非輪回親本(供體親本)基因、遺傳背景為輪回親本(受體親本)的導入系。常規(guī)方法回交創(chuàng)制導入系存在目標基因隱性、或顯性但無表達條件時的正向選擇困難，來自于供體親本的與目標基因緊密連鎖不良基因的連鎖累贅，以及回交世代過多等障礙。MAS技術回交轉育創(chuàng)制植物目標基因導入系，可以不受基因顯隱性及選擇條件的限制，有效地打破連鎖累贅，提高選擇效率，縮短植物育種工作年限[24]。Zhang J等[25]、李孝瓊等[26]、張安寧等[27]、田大剛等[28]、曾文秀等[29]和陳傳華等[30]通過MAS技術創(chuàng)制或培育出了雙抗病蟲害、抗褐飛虱、抗稻瘟病、香型軟米及高產優(yōu)質抗病的水稻新種質或新品種。王偉等[31]利用MAS技術選育出一批含有3隱性基因、2隱性基因或單隱性基因的玉米近等基因系材料，為玉米品質育種和機理研究提供了材料基礎。MAS技術不僅應用于大田農作物育種，在黃瓜、番茄、辣椒、荔枝、煙草等蔬菜及經濟植物上也得到成功應用[32-39]。水稻是世界重要主糧作物，基因組小，是研究比較深透的模式植物。水稻全基因組序列已知，較多的基因被定位和克隆，在此背景下利用MAS技術對水稻基因進行轉育就成為了水稻育種工作極為有效的手段[40]。本研究利用MAS技術回交創(chuàng)制了背景恢復率達100%的候選水稻空育131(fgr)導入系，田間試驗選擇出了具有一致性及遺傳穩(wěn)定性的、與空育131主要農藝性狀沒有差異的空育131(fgr)導入系。應用《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法》(NY/T 1433-2014)中的所有48個SSR分子標記評估入選的空育131(fgr)導入系和空育131水稻，二者在這48個SSR分子標記上沒有差異，顯示二者為相同或極近似品種。同時，對入選的空育131(fgr)導入系的耐冷性、抗稻瘟病性、抗倒伏性、香味等性狀進行鑒定，早粳稻空育131(fgr)導入系具有香味，其他鑒定性狀與空育131相同。本研究已經成功地培育了水稻空育131(fgr)導入系。

作物品種的突破性進步往往在于關鍵性基因資源的發(fā)掘和利用。黑龍江省水稻品種基本為早粳稻純系品種[41]。目前黑龍江省特別是北部水稻主產區(qū)的水稻品種均直接或間接來自于日本水稻?？沼?31是引自于日本北海道的水稻材料，具有耐冷性強、早熟、豐產、株型清秀等特性，曾經是黑龍江省年種植面積最大的品種，也是中國粳稻年種植面積的紀錄保持品種[42-43]。近年黑龍江省新育成的品種與空育131比較，除了米質性狀有所提高、抗稻瘟病性有變化外，基本特征特性并沒有明顯改善，甚至有的新品種還不如空育131綜合性狀優(yōu)良。黑龍江省作物生長季節(jié)短，低溫天氣頻繁，寒區(qū)溫度低與水稻喜溫性是黑龍江省水稻生產的基本矛盾。每3～4年黑龍江水稻就有一次低溫冷害年[44]，耐障礙性冷害強是黑龍江水稻品種必須具備的基本特性，空育131是孕穗開花期耐冷性最強的水稻材料之一?？沼?31水稻品種適應區(qū)域是機械化水平高的黑龍江省水稻主產區(qū)。機械收割要求水稻品種具有較強的抗倒伏性。空育131水稻在生產上大面積應用多年，其抗倒伏性滿足機械收割要求。隨著經濟發(fā)展和人們生活水平提高，市場對稻米品質要求越來越高，稻米品質的優(yōu)劣直接影響水稻品種種植推廣和商品價值，香味是稻米的重要食味品質性狀之一[45]。空育131是非香味水稻，這也是限制其在生產上繼續(xù)大面積應用的原因之一。本研究成功賦予空育131水稻香味基因，同時保留了空育131的遺傳背景，培育了空育131(fgr)導入系。水稻空育131(fgr)導入系稻米具有香味，耐冷性和抗倒伏性與受體品種空育131沒有顯著差異。香米空育131(fgr)導入系可以在黑龍江省水稻生產上示范試種，具有在寒區(qū)綠色優(yōu)質水稻生產上推廣應用的可能性。