項(xiàng)芳芝 趙 凱 邵 倩 陶 芳

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

中國是農(nóng)業(yè)大國。根據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，截至2014年，我國糧食總產(chǎn)量已連續(xù)增長11年，2014年我國糧食總產(chǎn)量高達(dá)60 709.9萬t[1-2]。糧食在儲藏過程中，受溫濕度、含水量等因素影響，極易產(chǎn)生霉變。被真菌毒素污染的糧食不僅品質(zhì)下降，還威脅著人類的身體健康和生命安全。2008年，我國在進(jìn)出口貿(mào)易中，有164個批次花生遭到真菌毒素污染，其中162例花生受到黃曲霉毒素污染；2010年，長江中下游地區(qū)的小麥由于受到赤霉毒素的污染，導(dǎo)致幾百萬噸糧食無法食用。由霉變而造成的糧食損失可達(dá)到糧食總產(chǎn)量的1.5%～3%[3]。因此，糧食的霉變、毒素污染等問題已經(jīng)成為政府高度重視、社會關(guān)注的焦點(diǎn)。

近年來世界各國對糧食的安全儲藏越加重視，較為先進(jìn)的儲藏技術(shù)主要有氣調(diào)儲藏、低溫儲藏、環(huán)流熏蒸、生物防霉防蟲等[4-6]。氣調(diào)儲藏和低溫儲藏對糧倉密閉和隔熱性能的要求較高。環(huán)流熏蒸的方法應(yīng)用已久，但由于磷化氫具有較強(qiáng)的毒性，長期使用會引起害蟲產(chǎn)生抗藥性[7]。生物防霉防蟲技術(shù)具有安全無毒的優(yōu)點(diǎn)，對糧倉設(shè)備要求不高、使用方便，是近些年來研究較多的技術(shù)，但在實(shí)際應(yīng)用時仍面臨著高效、安全等問題。本文主要分析了糧食在儲藏期間霉變的原因、防霉劑的分類和對效果評價(jià)方法進(jìn)行了總結(jié)，為開展防霉劑的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供參考。

1 糧食霉變的原因

糧食霉變受到生物和非生物因素的影響。儲藏過程中，糧食作物種類、霉菌、溫度、濕度等都是影響糧食霉變的關(guān)鍵因素[8]。糧食霉變對糧食品質(zhì)產(chǎn)生一系列影響，如營養(yǎng)成分降低、發(fā)芽率下降、籽粒變色、變味等，嚴(yán)重?fù)p耗了糧食的食用價(jià)值，甚至導(dǎo)致糧食的使用價(jià)值完全喪失。

糧食中的微生物種類很多，主要有真菌、細(xì)菌、放線菌等。真菌是糧食霉變的關(guān)鍵“殺手”，如灰綠曲霉、黃曲霉、青霉等。細(xì)菌和放線菌等對糧食的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于真菌。此外，部分霉菌會產(chǎn)生毒素污染糧食。例如，水稻、小麥和玉米等谷物常受到黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赫曲霉毒素等真菌毒素的污染[9-10]。這些毒素對身體的組織、器官會產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，具有致癌、致畸作用。糧食中霉菌種類因不同的作物、耕作方式、儲藏條件而不同，有學(xué)者根據(jù)來源不同將其分為兩種類型：田間儲藏型和正常儲藏型[11]。而糧食在儲藏期間霉菌的種類和數(shù)量受種植區(qū)域、農(nóng)作物種類等因素影響差異較大[9,11]。

儲糧過程中霉菌的生長代謝與諸多因素有關(guān)，主要包括環(huán)境的溫濕度以及糧食的含水量。當(dāng)溫度、相對濕度和含水量等因素適宜時，霉菌生長旺盛，加速了糧食的霉變。有研究表明，糧食中的霉菌大都屬于中溫性霉菌，在30 ℃左右生長旺盛。例如，黃曲霉菌的最適生長溫度為28 ℃左右，禾谷鐮刀菌為25 ℃[10]。糧食入庫后，由于堆積和呼吸作用的影響，溫度升高，促進(jìn)微生物的生長和繁殖。當(dāng)相對濕度處于85%左右時，黑曲霉菌、黃曲霉菌和青霉菌等生長活躍；當(dāng)相對濕度在65%～70%時，灰綠曲霉、白曲酶等干生性霉菌生長活躍[12]。在我國的部分地區(qū)，受陰雨等惡劣天氣的影響，空氣濕度較大，即使溫度較低，入庫糧食也會再吸濕而導(dǎo)致含水量高于安全儲藏水分，霉菌活動加劇[13]。這一情況在我國南方高溫高濕地區(qū)顯得尤為嚴(yán)重。

2 防霉劑的種類

防霉劑是一類抑制霉菌生長的化學(xué)物質(zhì)，在糧食儲藏過程中可直接添加到原糧中。不同的霉菌對特定的防霉劑敏感程度不同。由于防霉劑與食品安全緊密相關(guān)，因此對防霉劑的使用具有嚴(yán)格的限定標(biāo)準(zhǔn)。防霉劑應(yīng)具有以下四個基本條件[14]：1)對霉菌具有高效性和廣譜性；2)對人和動物的危害盡可能小，且不造成毒素累積作用；3)穩(wěn)定性強(qiáng)，不對糧食的品質(zhì)產(chǎn)生影響；4)原料易得，生產(chǎn)成本低。此外，防霉劑必須通過相關(guān)管理部門的安全性驗(yàn)證，才能用于原糧中。目前有關(guān)糧食的防霉劑的研究和應(yīng)用，主要有物理防霉劑、化學(xué)防霉劑、生物源防霉劑三種類型。

2.1 物理防霉劑

Ag、Zn、Cu等金屬離子及其氧化物具有抗菌功能，通常利用合適的載體來緩釋這種抑菌物質(zhì)，以達(dá)到抑菌效果。如將納米氧化鋅負(fù)載在沸石、天然膨潤土中，可明顯提高納米氧化鋅的抗菌性能。其中膨潤土——納米氧化鋅復(fù)合體對黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赭曲霉毒素等多種霉菌毒素都具有較好的吸附效果；但防霉劑中的天然膨潤土、沸石等載體對營養(yǎng)成分也具有吸附作用，降低了糧食、飼料等的利用價(jià)值[14-15]。Li等[15]將納米銀抗菌劑添加到包裝膜材料中，與聚乙烯包裝材料相比，對黃曲霉菌的生長抑制率提高了23.3%。該包裝材料不僅具有防霉、延長貨架期的作用，對食品的色澤、口感等也沒有影響。

2.2 化學(xué)防霉劑

2.2.1 丙酸和丙酸鹽

丙酸是一種無色液體，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味。同時，丙酸也是人體內(nèi)分泌的一種正常代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)能量代謝。研究表明，丙酸及丙酸鹽類都對霉菌、真菌具有明顯的抑菌效果。丙酸的穿透能力強(qiáng)，能夠穿透細(xì)胞壁，進(jìn)入霉菌及其孢子中，抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而殺死霉菌及其孢子[16]。杜莉等[18]比較了丙酸、丙酸銨、谷氨酸鈉三種液體防霉劑的抑菌效果發(fā)現(xiàn)丙酸、丙酸銨的抑菌效果優(yōu)于谷氨酸鈉。另有學(xué)者指出，丙酸鹽的抑菌成分是丙酸分子，而不是鹽類[19]。丙酸型防霉劑由于具有安全高效、抑菌譜廣的特點(diǎn)，已在糧食、飼料等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但市場上的丙酸大多是化學(xué)方法合成，污染嚴(yán)重，且對合成設(shè)備要求高，使得丙酸的合成成本大大提高。

2.2.2 苯甲酸和苯甲酸鹽

苯甲酸可降低細(xì)胞膜的通透性，阻礙氨基酸吸收，影響膜內(nèi)呼吸酶的合成。苯甲酸及其鹽類對酵母菌、細(xì)菌和霉菌等的抑制效果較好[20]。當(dāng)苯甲酸濃度為0.1%時，可將孢子萌發(fā)率降低33%～55%，對菌絲的生長抑制最高可達(dá)97%[21]。苯甲酸及其鹽類有一定的致突變作用、遺傳毒性，但無致畸作用，是輕度蓄積物質(zhì)[22]。目前，苯甲酸及其鹽類主要集中應(yīng)用在對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制，在醫(yī)療和食品等方面應(yīng)用廣泛。而在抑制霉菌的應(yīng)用方面，發(fā)現(xiàn)將苯甲酸鈉與肉桂精油復(fù)配使用，對黃曲霉菌的生長抑制具有協(xié)同作用[23]。

2.2.3 山梨酸和山梨酸鹽

山梨酸外觀為無色針狀結(jié)晶或白色結(jié)晶粉末，無味、無臭。山梨酸能與微生物酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，從而影響酶的活性，達(dá)到抑制霉菌的生長和繁殖，具有較高的抗菌活性[24]。山梨酸鉀對曲霉菌、酵母菌的抑制效果強(qiáng)于細(xì)菌，其最低抑制濃度僅為對細(xì)菌的1/6[25]。此外，將山梨酸及鹽類與其他幾種防霉劑復(fù)配使用，可進(jìn)一步擴(kuò)大抑菌譜，提高防霉劑的應(yīng)用范圍。如將紫蘇油與山梨酸鉀復(fù)配，發(fā)現(xiàn)這兩種抗菌劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有協(xié)同作用[26]。山梨酸鉀的毒性僅為苯甲酸的1/4，是一種安全、相對無毒的食品添加劑，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織等機(jī)構(gòu)公認(rèn)為高效防腐、防霉劑。

2.2.4 雙乙酸鈉

雙乙酸鈉分子中的乙酸分子可以穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞中，降低細(xì)胞內(nèi)的pH，影響細(xì)胞內(nèi)生物酶活性。雙乙酸鈉對霉菌、細(xì)菌及真菌均有較強(qiáng)的抑制性，且具有生產(chǎn)成本低、無毒、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，美國、加拿大、德國等發(fā)達(dá)國家都已將雙乙酸鈉大規(guī)模用于食品、糧食、飼料等防霉防腐中。20世紀(jì)末，我國也將雙乙酸鈉作為糧食和食品的防霉劑之一。付春麗[27]比較了10種抗菌劑對飼料青儲期間毛霉、米根霉、止青霉、斜臥青霉的抑制作用，發(fā)現(xiàn)雙乙酸鈉對毛霉的的抑制效果最佳，而對其他霉菌的抑制效果一般。而雙乙酸鈉和乳酸鏈球菌素復(fù)配，不僅擴(kuò)大了抑菌譜，還起到了協(xié)同作用，增強(qiáng)了抑菌能力；此外，防霉劑在使用過程中，通過檸檬酸鈉等物質(zhì)調(diào)節(jié)pH，能夠使抑菌率達(dá)到95.98%[28]。

2.3 生物源防霉劑

生物源防霉劑具有來源豐富、綠色安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，在食品、農(nóng)產(chǎn)品和中藥材等防霉中已有運(yùn)用[29]。迄今為止，生物源防霉劑主要來源植物和動物兩個方面。

2.3.1 生物源防霉劑——植物源

植物中含有大量的化合物，其中脂肪族類、芳香族類和萜類等化合物具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等功效[30]。通過蒸餾法、超聲波法將植物中的這些生物活性物質(zhì)進(jìn)行提取，形成油狀且具有揮發(fā)性的化合物—精油。精油來源廣泛，主要有香辛料、中草藥、果蔬、野生植物、曲酸、食用菌[31]。目前，對植物精油的熱點(diǎn)主要集中在香辛料和中草藥中。

精油中的化學(xué)成分復(fù)雜，除六大基本營養(yǎng)元素外，還含有揮發(fā)油、酚類、萜類等化合物。這些物質(zhì)可以通過酶抑制作用或巰基反應(yīng)來抑制微生物的活動[32]。其中，香辛料中的揮發(fā)油等成分在防霉、防腐中已進(jìn)行廣泛研究。通過氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，精油中起到抑菌作用的物質(zhì)主要為醛類、酚類、酯類和醇類[33-35]。精油的抑菌效果受到溫度的影響，Santiago等發(fā)現(xiàn)[36]：15 ℃時精油對赭曲霉毒素A的抑制效果好于25 ℃。此外，Boukaew等[33]發(fā)現(xiàn)丁香精油在10L/L時，能夠完全抑制玉米種子的病蟲害感染，而在100L/L時，對黃曲霉菌PSRDC-2的分生孢子抑制率僅達(dá)到84.7%；這種現(xiàn)象可能與菌株的類型有關(guān)。精油對霉菌生長和產(chǎn)毒也具有抑制作用，其作用機(jī)制也是近年來研究的熱點(diǎn)。有研究表明，精油是通過降低細(xì)胞質(zhì)膜中麥角甾醇的含量、線粒體ATP酶活性、琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等酶活性而起到抑菌或殺菌的目的[37]。由于大部分植物精油來自藥材食材，對人體的危害小。因此，將植物精油作為防霉熏蒸劑，是一種安全、高效的生物源防霉劑，在糧食的天然保鮮、防霉等方面具有重要的開發(fā)價(jià)值。

2.3.2 生物源防霉劑——動物源

和植物源防霉劑相比，動物源防霉劑研究相對較少。近些年，昆蟲抗菌肽、殼聚糖以及魚精蛋白為主要研究對象。呂丁丁等[38]對家蠶抗菌肽抑制細(xì)菌的作用機(jī)理進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽具有穿透細(xì)胞膜功能，并與DNA和RNA相互作用，致使細(xì)菌死亡。另外對殼聚糖及其鹽類物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖鹽類物質(zhì)的抑菌效果明顯高于殼聚糖。將殼聚糖與金屬離子Cu、Zn等復(fù)合，對殼聚糖的抑菌效果明顯提高，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0 g/kg時，抑菌效果最佳[39]。殼聚糖是一種天然化合物，無毒副作用，將其與金屬離子復(fù)合，形成殼聚糖鹽，在食品、醫(yī)療等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

以上三類防霉劑各有優(yōu)缺點(diǎn)(表1)，目前，仍處于不斷的探索和研究中。從物理防霉劑到生物源防霉劑，不同來源的防霉劑在不斷地被挖掘，以期達(dá)到廣譜高效、安全低毒的目的。

表1 三類防霉劑在應(yīng)用過程中的優(yōu)勢和不足

3 防霉劑效果評價(jià)方法

防霉劑防霉效果的評價(jià)方法較多，主要有兩個方面：一是防霉劑的抑菌效果，通常是讓防霉劑只作用于菌體，確定其是否具有抑菌功能；二是以糧食為載體進(jìn)行的防霉效力測定，主要是檢測防霉劑在模擬或?qū)嶋H儲糧過程中，對霉菌的抑制效果。目前，常見的評價(jià)方法有以下幾種。

3.1 防霉劑抑菌效果分析

3.1.1 抑菌圈法

抑菌圈法是指防霉劑點(diǎn)接在培養(yǎng)霉菌的瓊脂平板上，使其周圍的菌落生長受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。抑菌圈法是一種初步評價(jià)方法，通常用來判斷某種物質(zhì)是否具有抑菌效果或比較幾種物質(zhì)的抑菌效果強(qiáng)弱[37]。在進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)時，由于抑菌圈的大小受防霉劑種類、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度等因素的影響，因此選擇適當(dāng)?shù)臈l件，是抑菌實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵[40]。 抑菌圈法操作方便，通過比較抑菌圈直徑大小可知抑菌效果，是防霉劑效力的初步檢測方法。

3.1.2 最低抑菌濃度

最低抑菌濃度法是一種定量方法，能夠較為精確地測定防霉劑的抑菌能力。抑菌測定的方式可采用固體培養(yǎng)基，也可以在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，但對抑菌程度的評價(jià)方法不一。最低抑菌濃度一般是指在某一濃度下，無菌生長，則該濃度為最低抑制濃度。但也有學(xué)者認(rèn)為最低抑制濃度是當(dāng)抑菌劑對菌絲生長抑制率為50%時，該濃度為最低抑制濃度[41]。在實(shí)際操作過程中，通常采用菌落數(shù)、OD值和革蘭氏染色等方法來判斷最低抑菌濃度[42-44]，由于最低抑菌濃度在測定過程中受到接菌量、培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)基等條件的影響，因此在利用最低抑菌濃度法評估防霉劑的抑菌效果時，建議至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)和三組平行實(shí)驗(yàn)，以達(dá)到較為穩(wěn)定的數(shù)據(jù)結(jié)果。

3.1.3 最低殺菌濃度

為了更為精準(zhǔn)地評價(jià)防霉劑的抑菌效果，常對防霉劑的最低殺菌濃度進(jìn)行測定。目前，研究者主要在兩個方面對最低殺菌濃度進(jìn)行測定。一是將不同濃度的防霉劑和含有霉菌孢子的培養(yǎng)基混合，當(dāng)孢子的致死率達(dá)到99.9%以上，該濃度為最低殺菌濃度[45]。二是在最低抑菌濃度的基礎(chǔ)上，增大抑菌劑濃度，延長培養(yǎng)時間，若無菌落生長，則為最低殺菌濃度[46]。最低殺菌濃度對孢子的致死率要求很高，但霉菌孢子的數(shù)量、培養(yǎng)基pH等因素對準(zhǔn)確率會有影響。因而要求在比較防霉劑的最低殺菌濃度時，實(shí)驗(yàn)條件要保持一致。

3.2 防霉劑在糧食中防霉效果的檢測方法

防霉劑效果的評價(jià)通常先進(jìn)行防霉劑的抑菌效果的初步評價(jià)，再對防霉劑在糧食中的防霉效果進(jìn)行檢測。糧食防霉效果評估主要考察籽粒的菌相、菌量、萌發(fā)率、營養(yǎng)成分、相關(guān)酶活性等指標(biāo)。在儲藏過程中，糧食籽粒的質(zhì)量、初始菌相菌量、防霉劑的投放方式、溫濕度等均會影響防霉劑的防霉效果。模擬儲藏條件下，若采用糧食接種目標(biāo)霉菌來測定防霉效果，還需先對糧食籽粒進(jìn)行無菌處理，目前常采用的方法有：1)NaClO4或酒精進(jìn)行表面消毒；2)γ射線進(jìn)行完全滅菌[10]。另外，防霉劑運(yùn)用于實(shí)際儲糧是防霉效果評價(jià)的最后環(huán)節(jié)，也是極為重要的一步，可以反映真實(shí)的儲糧條件下防霉劑的防霉效果。

在防霉劑效果評價(jià)過程中，一些學(xué)者選擇細(xì)菌作為抑菌對象，雖然能夠驗(yàn)證該物質(zhì)具有抑菌能力，但在糧食儲藏中，影響糧食品質(zhì)的主要為霉菌，防霉劑對細(xì)菌的抑制，不能反映出對霉菌也有很好的抑制效果。因此，防霉效果評價(jià)時要注意抑菌對象的選擇對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

4 展望

國內(nèi)外關(guān)于糧食防霉劑的研究報(bào)道均表明，精油具有綠色、安全、高效等特點(diǎn)，對糧食中黃曲霉和青霉菌等具有較強(qiáng)的抑制效果，且對黃曲霉毒素、嘔吐毒素等毒素的合成有抑制作用，是一種較為理想的糧食防霉劑，在糧食儲藏中具有良好的應(yīng)用前景。然而在實(shí)際生產(chǎn)使用過程中，面臨著諸如提取成本高、應(yīng)用工藝尚未成熟等問題，阻礙了在糧食儲藏中的應(yīng)用。植物源防霉劑若要在糧食儲藏中得以廣泛應(yīng)用，還需要進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化：1)精油中的檸檬醛、肉桂醛、丁香酚等成分是影響抑制霉菌生長的主要成分，可以通過人工化學(xué)合成的方法，降低提取成本。但某些成分存在異構(gòu)現(xiàn)象如檸檬醛、肉桂醛，天然存在時只為其中的一種構(gòu)型(反式)，而在化學(xué)合成過程中，易產(chǎn)生對應(yīng)的異構(gòu)體(順式)，降低了有效成分的產(chǎn)率。所以，還需對反式檸檬醛、反式肉桂醛等物質(zhì)合成工藝進(jìn)行探索和研究，提高單一目標(biāo)成分，減少異構(gòu)體。2)在在應(yīng)用時，精油除了可以利用糧倉已有的環(huán)流熏蒸管道進(jìn)行短時間高濃度熏蒸外，也可以制成微膠囊、脂質(zhì)體等緩釋產(chǎn)品，增加精油釋放的穩(wěn)定性、延長其釋放時間，達(dá)到長期防霉效果。為了提高緩釋產(chǎn)品包埋率，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化包埋工藝。如采用冷凍干燥法來增大精油乳液顆粒的表面積等。3)大都數(shù)精油都具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，如肉桂精油、牛至精油等，導(dǎo)致糧食也具有一定的氣味，降低糧食及其副產(chǎn)品的使用價(jià)值。因此，如何將精油中的刺激性氣味去除，同時不影響防霉效果，仍需要進(jìn)一步探究。