謝敏，李紅霞，顧馨儀，郝舒捷，王仁軍，劉慶平，秦建中，張帆

(1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116001；2 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 遼寧省糖脂代謝研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率高，容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。目前，手術(shù)切除腫瘤組織仍是結(jié)腸癌的主要治療方法，但清除殘留的原位或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，需要機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)和有效的化療藥物。腫瘤細(xì)胞代謝活躍,其生長(zhǎng)增殖高度依賴糖酵解途徑。己糖激酶抑制劑2-D-脫氧葡萄糖(2-DG)可抑制糖酵解代謝，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和死亡。然而，近年臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)使用2-DG對(duì)腫瘤患者的治療效果并不顯著，但與其他抗癌藥物聯(lián)合使用還有很大的研究空間。二甲雙胍是用于糖尿病尤其是2型糖尿病治療的常用口服降糖藥物。近年研究表明，二甲雙胍具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性等功能[2]。新近研究表明，降低葡萄糖水平或減少葡萄糖利用，可以顯著增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用[3]，但作用機(jī)制仍不明確。2017年1月～2018年6月，我們觀察了二甲雙胍與2-DG聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的抗腫瘤效果，并通過(guò)檢測(cè)蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)變化探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 2-DG、二甲雙胍購(gòu)自Sigma公司；HT29細(xì)胞由伊利諾斯大學(xué)芝加哥校區(qū)醫(yī)學(xué)院微生物和免疫系提供，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素均購(gòu)自Hyclone公司；MTT、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、Bradford蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑由上海生工提供；細(xì)胞凋亡檢測(cè)用Annexin-V染液和碘化丙啶(PI)試劑盒來(lái)源于Bio Vision公司；AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白[AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、核糖體p70S6激酶(p70S6K)、磷酸化核糖體p70S6激酶(p-p70S6K)]、p62及GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，p-AKT抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，HRP山羊抗兔IgG、HRP山羊抗小鼠IgG、HRP驢抗山羊IgG由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供，ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于北京Transgene公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HT-29細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、100 μg/mL抗生素的DMEM培養(yǎng)液，放置在飽和濕度、5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力觀察 采用臺(tái)盼藍(lán)染色法。將HT-29細(xì)胞以1×105/孔接種于12孔培養(yǎng)板，37 ℃孵育過(guò)夜。單獨(dú)或者聯(lián)合加入不同終濃度的2-DG(1、5、10 mmol/L)和二甲雙胍(5、10 mmol/L)，每個(gè)處理設(shè)2個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用胰酶消化后，離心收集細(xì)胞，再用0.5 mL培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸。取細(xì)胞懸液10 μL與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液10 μL混合均勻后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞死亡率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT摻入法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，37 ℃孵育過(guò)夜。加入含終濃度10 mmol/L 2-DG或與不同終濃度二甲雙胍(0、1、5、10、15、20 mmol/L)聯(lián)合的培養(yǎng)液100 μL，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照只加同體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；終止培養(yǎng)前4 h，于各個(gè)處理孔加入5 mg/mL MTT溶液15 μL。取出96孔板，棄除原培養(yǎng)液；每孔加入DMSO 100 μL，往復(fù)式搖床震蕩10 min至有色沉淀完全溶解；多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率%=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。將HT-29細(xì)胞接種于6孔板，3×105/孔。次日單獨(dú)或者聯(lián)合加入不同濃度2-DG(5、10 mmol/L)和10 mmol/L二甲雙胍，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)時(shí)，合并收集各孔漂浮與貼壁細(xì)胞于15 mL離心管，離心，并用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞1次。向各管加入0.5 mL含5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI的PBS，避光孵育10 min；300目網(wǎng)篩過(guò)濾后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡(早期和晚期凋亡細(xì)胞)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞中AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白p62檢測(cè) 采用免疫印跡法。將HT-29細(xì)胞接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁后單獨(dú)或者聯(lián)合加入不同濃度2-DG(5、10 mmol/L)和10 mmol/L二甲雙胍處理。培養(yǎng)24 h后，用細(xì)胞刮匙充分刮取細(xì)胞；離心沉淀細(xì)胞后，用PBS洗細(xì)胞1次。加入適量NP-40裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞至勻質(zhì)；冰上裂解30 min，每隔5 min渦旋震蕩1次；4 ℃離心，保留上清為全細(xì)胞蛋白。參照蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作步驟，Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。從每個(gè)樣品取30 μg蛋白質(zhì)，與4×加樣緩沖液混合后，煮沸變性；上樣到預(yù)先制備的SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳后，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；麗春紅染色檢查蛋白轉(zhuǎn)膜效果，接著用5%脫脂牛奶于室溫震蕩封閉1 h。將膜置于TBS-T溶液中，并加入適量稀釋的相應(yīng)一抗于4 ℃孵育過(guò)夜；吸除一抗，2.5%脫脂牛奶洗膜2次；在室溫下與相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗膜。取ECL顯影氧化劑、發(fā)光劑各500 μL與加強(qiáng)劑1 μL混合均勻，滴加至欲顯影的PVDF膜上；將膜置于凝膠成像儀中，獲取目的蛋白圖像。以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度2-DG、二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24 h后HT-29細(xì)胞死亡率比較 不同濃度2-DG(1、5、10 mmol/L)和二甲雙胍(5、10 mmol/L)聯(lián)合處理24 h后，HT-29細(xì)胞死亡率均高于單藥處理的細(xì)胞(P均<0.05)；在2-DG、二甲雙胍均為10 mmol/L時(shí)，HT-29細(xì)胞死亡率最高(P均<0.01)。見(jiàn)圖1。

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，*P<0.05；與同濃度單獨(dú)二甲雙胍處理比較，#P<0.05。

圖1不同濃度2-DG、二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24h后HT-29細(xì)胞死亡率比較

2.2 2-DG與不同濃度二甲雙胍聯(lián)合處理48 h后HT-29細(xì)胞存活率比較 以10 mmol/L 2-DG與不同濃度的二甲雙胍(0、1、5、10、15、20 mmol/L)聯(lián)合處理48 h，在二甲雙胍濃度≥5 mmol/L后HT-29細(xì)胞存活率低于單藥處理的細(xì)胞(P均<0.05)，10 mmol/L時(shí)HT-29細(xì)胞存活率最低(P均<0.01)，20 mmmol/L時(shí)HT-29細(xì)胞存活率未繼續(xù)明顯降低。見(jiàn)圖2。

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，*P<0.05，**P<0.01；與同濃度單獨(dú)二甲雙胍處理比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖22-DG與不同濃度二甲雙胍聯(lián)合處理48h后HT-29細(xì)胞存活率比較

2.3 不同濃度2-DG與10 mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24 h后HT-29細(xì)胞凋亡率比較 不同濃度2-DG(5、10 mmol/L)和10 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合處理24 h，5 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞凋亡率與單藥處理細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，10 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞凋亡率高于單藥處理細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，**P<0.01；與同濃度單獨(dú)二甲雙胍處理比較，##P<0.01。

圖3不同濃度2-DG與10mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24h后HT-29細(xì)胞凋亡率比較

2.4 不同濃度2-DG與10 mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24 h后HT-29細(xì)胞中AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 不同濃度2-DG(5、10 mmol/L)和10 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合處理24 h，5 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞凋中AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，10 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞中p-AKT、p-p70S6K相對(duì)表達(dá)量低于單藥處理細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)圖4A、4B。

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，*P<0.05。

圖4A不同濃度2-DG與10mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24h后HT-29細(xì)胞中p-AKT和AKT蛋白表達(dá)比較

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，*P<0.05。

圖4B不同濃度2-DG與10mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24h后HT-29細(xì)胞中p-70S6K和p70S6K蛋白表達(dá)比較

2.5 不同濃度2-DG與10 mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24 h后HT-29細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)比較 不同濃度2-DG(5、10 mmol/L)和10 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合處理24 h，5 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，10 mmol/L 2-DG與二甲雙胍處理時(shí)HT-29細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量低于單藥處理細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與同濃度單獨(dú)2-DG處理比較，*P<0.05。

圖5不同濃度2-DG與10mmol/L二甲雙胍單藥或聯(lián)合處理24h后HT-29細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)比較

3 討論

己糖激酶抑制劑2-DG是葡萄糖2號(hào)碳原子上的羥基被氫替換的化合物。它與葡萄糖的結(jié)構(gòu)相似，通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)積累，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制己糖激酶與葡萄糖的反應(yīng)[4,5]。由于腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，但新生血管的生成相對(duì)滯后，提供的營(yíng)養(yǎng)和氧氣不能滿足腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的需要。因此，腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)低氧環(huán)境，主要依賴糖酵解代謝產(chǎn)生能量，即使在恢復(fù)供氧的情況下仍以糖酵解為主，這就是腫瘤代謝的Warburg效應(yīng)[6]。2-DG與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合己糖激酶，但不能被6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶識(shí)別，轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，從而抑制糖酵解代謝，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和死亡。而正常細(xì)胞主要以氧化磷酸化合成ATP，部分抑制糖酵解對(duì)正常細(xì)胞的功能影響較弱[7,8]。此外，糖酵解途徑也為腫瘤細(xì)胞增殖提供合成大分子的必要中間產(chǎn)物，抑制糖酵解將干擾腫瘤細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，腫瘤細(xì)胞的這種能量代謝特征為糖酵解抑制劑的靶向治療提供了可能。大量流行病學(xué)研究表示，使用二甲雙胍的糖尿病患者，其惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率較低，表明二甲雙胍可減少糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。二甲雙胍作為治療糖尿病的一線藥物，其安全性已得到廣泛驗(yàn)證。有學(xué)者指出，將二甲雙胍與化療藥物如多柔比星、卡鉑聯(lián)合用于乳腺癌動(dòng)物模型，它們具有協(xié)同抗腫瘤作用[9]。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用2-DG或二甲雙胍對(duì)HT-29結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞僅有較弱的抗腫瘤作用，當(dāng)兩者終濃度均為10 mmol/L時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用能使抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用達(dá)到最適狀態(tài)。

由于2-DG通過(guò)與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合己糖激酶,干擾細(xì)胞糖代謝過(guò)程，其有效濃度會(huì)伴隨環(huán)境中葡萄糖含量有所差異。在本實(shí)驗(yàn)條件下，普通高糖DMEM培養(yǎng)液中葡萄糖濃度約25 mmol/L，這可能是本文只觀察到較高濃度2-DG增強(qiáng)二甲雙胍抗腫瘤作用的原因之一。近年研究表明，二甲雙胍抗腫瘤作用主要是通過(guò)影響細(xì)胞能量代謝來(lái)抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒作用并不明顯[10]；但在缺乏或低葡萄糖條件下，其抗腫瘤作用明顯增強(qiáng)[11]。本研究觀察到顯效的二甲雙胍濃度高于生理?xiàng)l件所及，這可能與細(xì)胞生長(zhǎng)于高糖環(huán)境有關(guān)，并不代表體內(nèi)作用的有效濃度。本研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，抑制細(xì)胞糖代謝能增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用。二者抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制和作用途徑不同，盡管單獨(dú)使用抗瘤作用較弱，但聯(lián)合使用卻可顯著產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)，因此有望成為理想的聯(lián)合用藥候選組合。

AKT/mTOR信號(hào)通路是已知的癌癥發(fā)生相關(guān)的主要信號(hào)通路之一，其生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)為阻止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活以及影響細(xì)胞糖代謝等方面[12]?；罨腁KT通過(guò)激活下游激酶mTOR，導(dǎo)致p70S6K和4EBP1磷酸化，后兩者的協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成代謝。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都存在PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路異常度活化[13]，該通路在防止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活以及增強(qiáng)細(xì)胞代謝等方面具有重要作用[14]。最近有研究表明，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞的更新和放療、化療抵抗中扮演重要的角色，而后兩者被認(rèn)為是癌癥治療失敗的主要原因[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度(5 mmol/L)2-DG單獨(dú)處理HT-29細(xì)胞對(duì)p-AKT蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，而高濃度(10 mmol/L)2-DG則可促進(jìn)AKT磷酸化。二甲雙胍單獨(dú)處理可以抑制AKT磷酸化，這種抑制作用在2-DG為10 mmol/L的條件下更為顯著。p70S6K是mTOR信號(hào)復(fù)合體的下游靶蛋白，雖然2-DG對(duì)其沒(méi)有明顯影響，但能顯著增強(qiáng)二甲雙胍對(duì)p-p70S6K蛋白表達(dá)的抑制作用。值得注意的是，2-DG和二甲雙胍聯(lián)合作用下，p70S6K總蛋白也有下調(diào)趨勢(shì)。因此，2-DG聯(lián)合二甲雙胍顯著抑制AKT和p70S6K的磷酸化，提示抑制AKT/mTOR信號(hào)系統(tǒng)是兩者聯(lián)合增強(qiáng)抗腫瘤效果的機(jī)制之一。

本研究還觀察到，二甲雙胍能夠上調(diào)p62蛋白表達(dá)，而2-DG可以阻斷這一作用。p62是一種多功能蛋白，尤其在細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。二甲雙胍上調(diào)p62蛋白表達(dá)，提示它可能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞自噬反應(yīng)是導(dǎo)致治療抵抗的原因之一[17]，因此2-DG阻斷p62蛋白上調(diào)可能是二者協(xié)同另一機(jī)制。此外，新近研究發(fā)現(xiàn)，p62蛋白是轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活劑，后者是導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用的重要轉(zhuǎn)錄因子[18]。這提示2-DG與二甲雙胍的聯(lián)合抗腫瘤作用與抑制Nrf2活化也有關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)2-DG和二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抗瘤效應(yīng)，其作用機(jī)制之一是二者聯(lián)合抑制AKT/mTOR信號(hào)系統(tǒng)，也可能與抑制細(xì)胞自噬與Nrf2活化有關(guān)。因此，這兩種藥物組合在體內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌的作用值得進(jìn)一步研究。