鄭羽飄，錢寶鑫，覃琴，駱瑩，朱爭艷，高英堂，王鳳梅

(1 天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院,天津300170；2 天津市第三中心醫(yī)院)

乙肝病毒(HBV)的慢性感染與肝細(xì)胞肝癌(簡稱肝癌)的發(fā)生密切相關(guān)[1]，抑制HBV復(fù)制對于預(yù)防肝癌意義重大。臨床研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)慢乙肝患者經(jīng)過抗病毒治療實(shí)現(xiàn)了HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，但如果HBsAg陽性仍將發(fā)生肝癌[2]。更多研究表明，編碼HBsAg的S基因可以發(fā)生突變，而含有突變S基因的肝細(xì)胞更傾向于發(fā)生癌變[3～6]。因此，我們假設(shè)S基因Pre-S區(qū)突變是獨(dú)立于HBV-DNA復(fù)制引發(fā)肝癌的風(fēng)險(xiǎn)因素。2017年12月～2018年8月，我們擬構(gòu)建人肝癌細(xì)胞HepG2 HBV S基因pre-S1缺失突變及pre-S2缺失突變的穩(wěn)定株，觀察pre-S區(qū)缺失突變后細(xì)胞增殖及遷移能力變化，為探討肝癌的進(jìn)展機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 帶有FLAG標(biāo)簽的pLVX慢病毒質(zhì)粒載體(pLenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro)以及pLVX-Pre-S/S、pLVX-Pre-S1 mut/S、pLVX-Pre-S2 mut/S的慢病毒液由上海和元公司合成構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ購自Termo公司。HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存，DMEM高糖培養(yǎng)基及特級胎牛血清購自BI公司，胰酶購自Gibco公司，Polybrene購自合生基因公司。鼠源FLAG一抗購自Sigma公司，HMP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Cell Signaling Technology公司，RIPA蛋白裂解液及ECL化學(xué)發(fā)光底物購自碧云天公司。

1.2 HBV S基因Pre-S區(qū)野生型及突變型設(shè)計(jì) 以NCBI數(shù)據(jù)庫中JX661479.1的序列為HBV基因模板(全長3 215 bp)，明確編碼Pre-S/S的核苷酸序列(1 027～2 230 bp)，確定Pre-S1突變及Pre-S2突變的缺失位點(diǎn)(Pre-S1/S:1 220～1 291 bp；Pre-S2/S:1 397～1 450 bp，G1387A)，最終確定野生型Pre-S/S和突變型Pre-S1 mut/S、Pre-S2 mut/S的核苷酸序列信息。將信息提交上海和元公司，通過全基因合成獲取帶有EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的目的片段，并構(gòu)建慢病毒核心質(zhì)粒及相應(yīng)的慢病毒液。

1.3 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增、雙酶切驗(yàn)證及Sanger測序 利用PrimeSTAR DNA Polymerase分別以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒為模板行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶；利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒交付金唯智公司測序。

1.4 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)、分組、感染及穩(wěn)定株篩選 將肝癌細(xì)胞HepG2接種于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)6孔板中，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合度約70%時(shí)，隨機(jī)分為5組。空白對照組不處理，pLVX-vector組、野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組分別感染pLVX-vector、pLVX-Pre-S/S、pLVX-Pre-S1 mut/S、pLVX-Pre-S2 mut/S慢病毒液；36 h后棄含有病毒液的完全培養(yǎng)基，無菌1×PBS清洗2次；更換為含2.0 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，篩選至空白對照組HepG2細(xì)胞全部死亡，其余各組繼續(xù)加嘌呤霉素篩選48 h；于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況，更換為完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，篩選完畢。

1.5 HepG2細(xì)胞內(nèi)FLAG-HBV-S蛋白檢測 將pLVX-vector組、野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)，用RIPA裂解液冰上提取樣品蛋白；離心取上清液，用BCA法測蛋白濃度，用Western blotting法檢測細(xì)胞中的FLAG-HBV-S蛋白。

1.6 HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株增殖活性觀察 采用克隆形成試驗(yàn)。取pLVX-vector組、野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組細(xì)胞各1×103個(gè)，均勻接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)7、14 d。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的單細(xì)胞克隆點(diǎn)時(shí)，行結(jié)晶紫染色；于高倍顯微鏡下觀察10個(gè)不連續(xù)視野中的克隆點(diǎn)個(gè)數(shù)，并計(jì)算平均值。

1.7 HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。當(dāng)pLVX-vector組、野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組細(xì)胞融合率達(dá)95%時(shí)，接種于6孔板培養(yǎng)皿中；用10 μL的無菌白槍頭在細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕，PBS清洗2次，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于0、72 h用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。選取4個(gè)視野尺寸進(jìn)行拍照，根據(jù)顯微鏡下線性距離計(jì)算相對遷移距離，相對遷移距離即72 h距離-0 h距離。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的驗(yàn)證結(jié)果 構(gòu)建的pLVX-Pre-S/S、pLVX-Pre-S1 mut/S、pLVX -Pre-S2 mut/S重組表達(dá)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳檢測約為1 300 bp，與理論值(1 203、1 131、1 149 bp)相符，見圖1；經(jīng)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后電泳檢測為1 300 bp，與理論值(1 203、1 131、1 149 bp)相符，見圖2；Sanger測序結(jié)果顯示，pLVX-Pre-S/S堿基序列與GenBank (JX661479.1)上序列完全相同，pLVX-Pre-S1 mut/S、pLVX -Pre-S2 mut/S突變型除突變序列外，其他序列與HBV S基因野生型序列完全相同。

圖1 各質(zhì)粒PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株FLAG-HBV S蛋白的表達(dá) 在野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組43 kD分子量位置檢測到目的條帶表達(dá)，而pLVX-vector組無法檢測到相應(yīng)條帶的表達(dá)。見圖3。

2.3 HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株增殖活性比較 與pLVX-vector組同時(shí)點(diǎn)比較，其余各組克隆形成數(shù)增加(P均<0.05)；與野生型同時(shí)點(diǎn)比較，Pre-S2突變組克隆形成數(shù)增加(P均<0.05)。見表1。

2.4 HepG2細(xì)胞穩(wěn)定株遷移能力比較 pLVX-vector組、野生型組、Pre-S1突變組、Pre-S2突變組細(xì)胞相對遷移距離分別為(89.97±7.14)、(114.18±7.81)、(126.21±12.18)、(196.49±17.16)μm，Pre-S2突變組>野生型組、Pre-S1突變組>pLVX-vector組(P均<0.05)，野生型組、Pre-S1突變組相對遷移距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各質(zhì)粒EcoR Ⅰ及BamHⅠ雙酶切得到的片段

圖3 各組細(xì)胞FLAG-HBV-S蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

組別克隆形成數(shù)(個(gè))第7天第14天Pre-S2突變組94.67±11.55?#205.33±31.64?#Pre-S1突變組69.33±7.76?148.67±13.20?野生型組60.67±6.02?113.67±6.03?pLVX-vector組23.67±4.5165.33±4.73

注：與pLVX-vector組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與野生型同時(shí)點(diǎn)比較，#P<0.05。

3 討論

肝癌是世界第五大惡性腫瘤性疾病，病毒性肝炎始終是肝硬化、原發(fā)性肝癌的主要病因[7]。尤其在我國，慢性HBV感染仍是導(dǎo)致肝癌的首位病原學(xué)因素。目前臨床研究表明，抑制HBV復(fù)制對于延緩HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生起到非常重要的作用。但不可否認(rèn)的是，盡管臨床上已有眾多的患者通過核苷或核苷酸類似物成功抑制HBV的復(fù)制，依然有相當(dāng)一部分HBV-DNA陰性患者發(fā)生了肝惡性腫瘤，提示我們乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生，還可能與HBV其他因素存在內(nèi)在的聯(lián)系。乙肝S基因編碼HBsAg，HBsAg的陰轉(zhuǎn)一直是乙肝抗病毒治療的痛點(diǎn)。既往研究表明，S基因可以在Pre-S區(qū)發(fā)生缺失突變，該突變會(huì)導(dǎo)致HBV表面抗原大蛋白(LHBs)過度表達(dá)；LHBs可聚集于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成毛玻璃樣肝細(xì)胞(GGH)，GGH與肝硬化及肝癌高度相關(guān)[8～11]。Pre-S區(qū)缺失突變包括Pre-S1缺失突變及Pre-S2缺失突變。其中，Pre-S2區(qū)包含T細(xì)胞和B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，因此Pre-S2突變使T細(xì)胞和B細(xì)胞表位丟失；針對Pre-S2特異性T、B細(xì)胞免疫不能產(chǎn)生足夠的細(xì)胞因子和中和性抗體清除，導(dǎo)致HBV復(fù)制和疾病加重[12]，進(jìn)而導(dǎo)致HBV逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)控或減少主要組織相容性類似物的親和力[13]。同時(shí)，Pre-S區(qū)突變可影響HBV母嬰傳播免疫阻斷的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致免疫失敗。一項(xiàng)對來自亞洲國家和地區(qū)的兒童肝癌樣本研究發(fā)現(xiàn)，亞洲兒童肝癌患者中Pre-S區(qū)缺失變異率高達(dá)90%(27/30)[14]。

既往對于Pre-S區(qū)突變的研究尚不夠深入，現(xiàn)有的認(rèn)識(shí)包括Pre-S區(qū)變異可通過核因子κB和p38絲裂原活化蛋白激酶途徑上調(diào)環(huán)氧化酶[15]，或通過血管內(nèi)皮生長因子激活蛋白激酶B (Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)等通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過氧化應(yīng)激和DNA損傷促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性，促進(jìn)癌癥發(fā)生[9,14]。一些橫斷面研究，將發(fā)生肝癌患者進(jìn)行基因測序，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，肝癌患者有更高的Pre-S區(qū)缺失突變；但是，此研究忽略了HBV 基本核心啟動(dòng)子(BCP)區(qū)A1762/T1764雙突變也是公認(rèn)肝癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確設(shè)計(jì)了乙肝病毒S基因Pre-S1、Pre-S2缺失突變的突變位點(diǎn)，并將目的片段定向?qū)氲铰《据d體中，通過慢病毒感染的方式篩選獲得了能夠穩(wěn)定過表達(dá)HBV-S蛋白的HepG2穩(wěn)定株；并發(fā)現(xiàn)Pre-S2缺失突變的確可影響HepG2的細(xì)胞生物學(xué)行為，使HepG2獲得更強(qiáng)的增殖及遷移能力，提示惡性細(xì)胞表型增強(qiáng)。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了HBV Pre-S1、Pre-S2缺失突變的肝癌細(xì)胞HepG2穩(wěn)定株，其中Pre-S2缺失突變的HepG2穩(wěn)定株增殖活性、遷移能力更強(qiáng)。這為后續(xù)進(jìn)一步研究Pre-S缺失突變導(dǎo)致肝癌發(fā)生的下游信號(hào)通路及分子機(jī)制，以及深入研究Pre-S突變導(dǎo)致的免疫逃逸現(xiàn)象等奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。