時(shí)小東，吳 琪，譚茂玲，趙 鋼

(1.成都大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

苦蕎為一年生草本雙子葉植物，其在《本草綱目》、《齊民要術(shù)》及《神農(nóng)書》等古籍中均有記載，為一種藥食兼用的作物.苦蕎已有兩千多年的栽培歷史，研究表明，我國不僅是苦蕎的地理起源地，也是該物種的散布中心[1].作為一種典型的高寒陰涼氣候下生長的作物，我國苦蕎通常種植在西南高原山地和西北黃土高原山區(qū)，主要涉及四川、云南、貴州等省.苦蕎具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，能夠適應(yīng)高海拔地區(qū)的低溫、強(qiáng)輻射、土地貧瘠等不良環(huán)境[2].

研究證實(shí)，苦蕎中含有大量的黃酮類成分，主要以蘆丁為主，其次還包括黃酮醇、查爾酮、槲皮素與山奈酚等，具有降血脂、降血糖、抗氧化與抗癌等多種功效[3-4].Wang等[5]研究表明，苦蕎麩皮中黃酮類成分具有良好的DPPH清除率和ORAC值，表明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力.除黃酮類外，苦蕎中還富含其他活性物質(zhì)，Hu等[6]利用富含蕎麥d-手性肌醇的飼料進(jìn)行小鼠喂養(yǎng)，研究結(jié)果表明，苦蕎提取物能夠降低小鼠血糖水平，提升小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性，從而有望用于治療高血糖和肝臟氧化應(yīng)激損傷等.

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，苦蕎在遺傳多樣性分析、功能基因分析及組學(xué)分析方面取得了較大進(jìn)展.尤其是隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，在苦蕎中涌現(xiàn)出了大量的序列信息.截至2018年8月，在美國國家生物信息技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于苦蕎基因組序列信息已存有概覽序列23條，高通量序列1 760個(gè).本課題組也利用Illumina測序平臺，完成了苦蕎干旱和鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序分析[7].本研究綜述了苦蕎遺傳多樣性、基因組和轉(zhuǎn)錄組及功能基因等方面的研究進(jìn)展，并結(jié)合當(dāng)前研究的不足探討了苦蕎分子生物學(xué)未來的研究方向，擬為進(jìn)一步挖掘關(guān)鍵性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)和重要活性物質(zhì)的分子調(diào)控機(jī)理等方面的研究提供參考.

1 分子標(biāo)記和遺傳多樣性

與性狀(表型)鑒別和成分分析相比，基于分子水平的鑒定方法能夠排除環(huán)境和取材部位等諸多因素的干擾，具有重復(fù)性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn).目前，苦蕎分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于苦蕎遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源評價(jià)等方面.苦蕎分子水平鑒定技術(shù)主要分為兩類，一類是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子標(biāo)記技術(shù)；另一類是DNA序列標(biāo)記.基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳進(jìn)化分析中應(yīng)用較多，在苦蕎研究中具有較長的歷史.近年來，研究者通過體系優(yōu)化和引物篩選等方法對苦蕎分子標(biāo)記體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了更為有效的苦蕎分子標(biāo)記方法[8-9].在DNA序列標(biāo)記方面，核糖體ITS等序列具有種內(nèi)保守、種間差異的特點(diǎn)，已經(jīng)用于蕎麥種間和近緣屬間的遺傳多樣性分析[10].

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于組學(xué)的分子標(biāo)記技術(shù)在苦蕎中逐漸被建立，通過運(yùn)用苦蕎全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)，為苦蕎分子標(biāo)記提供了一條高效和簡便的途徑[11-12].

目前，蕎麥屬約有15種和2個(gè)變種，幾乎遍及所有栽培粒類作物的地區(qū)，我國有10種2變種，主要為苦蕎和甜蕎栽培種.屈洋等[13]對我國7個(gè)省份的83份苦蕎種質(zhì)資源進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明，北方產(chǎn)區(qū)(陜西、甘肅、寧夏)親緣關(guān)系較近，西南產(chǎn)區(qū)(四川、貴州、云南、西藏)親緣關(guān)系較近，此說明我國苦蕎群體具有一定的區(qū)域性，且兩大產(chǎn)區(qū)之間存在一定的遺傳物質(zhì)交換，西南苦蕎群體多態(tài)信息量差異不大，表明這些種質(zhì)資源可能具有相同的地理起源.黎瑞源等[14]利用EST-SSR技術(shù)對我國35個(gè)審定苦蕎品種進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，涉及“川蕎”、“晉蕎”、“黔蕎”等主要栽培品種，結(jié)果表明，苦蕎審定品種的各類群體之間沒有明顯的地域分布趨勢，其遺傳差異性較小、遺傳基礎(chǔ)狹窄，但能反映審定品種間的親緣關(guān)系.

遺傳連鎖圖譜不僅是重要功能基因克隆、基因結(jié)構(gòu)分析和關(guān)鍵性狀QTL定位的重要手段，也是利用分子育種技術(shù)對苦蕎優(yōu)良性狀進(jìn)行定向改良的關(guān)鍵.目前，構(gòu)建的苦蕎遺傳連鎖圖譜標(biāo)記相對較少、密度低，限制了QTL位點(diǎn)挖掘.遺傳圖譜將有助于苦蕎重要性狀的分離和分子標(biāo)記輔助育種工作的開展，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大作圖群體數(shù)量，構(gòu)建高密度和飽和度的遺傳圖譜，并基于田間數(shù)量性狀調(diào)查和基因功能分析等手段來驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，可為苦蕎種植關(guān)鍵農(nóng)藝性狀的改良提供精準(zhǔn)目標(biāo).

2 基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)

研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎繁殖為嚴(yán)格的自花授粉，從而基因雜合度較低，加之其基因組相對較小，適合全基因組測序.Logacheva等[15]運(yùn)用Illumina測序技術(shù)對苦蕎進(jìn)行全基因組測序，共組裝得到了372 Mb的序列，約占苦蕎全基因組大小的70%.Zhang等[16]選擇苦蕎Pinku1材料，采用三代測序和光學(xué)圖譜等技術(shù)，綜合Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C等測序方法，得到了高質(zhì)量全基因組數(shù)據(jù)；最終獲得基因組全長為498.3 Mb，Contigs數(shù)目為8 778個(gè)，其Contig N50為550.7 Mb，共預(yù)測得到33 366個(gè)基因，GC含量為37.8%；通過光學(xué)圖譜分析，436.4 Mb序列能夠錨定到8條染色體上，定位比例高達(dá)89.18%.為了進(jìn)一步驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，作者還利用GeneBank數(shù)據(jù)庫中的97條mRNA序列對組裝序列完整性進(jìn)行評估，結(jié)果表明，其覆蓋度占比為99.36%，進(jìn)一步驗(yàn)證了其基因組組裝的高精度.除核基因組外，Liu等[17]也完成了苦蕎葉綠體基因組測序工作，苦蕎cpDNA全長為159 272 bp，GC含量為37.9%，含有79個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因，其結(jié)論與Cho等[18]的cpDNA測序結(jié)果相一致.

基于二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序具有成本低、覆蓋度廣、效率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速全面地獲得基因表達(dá)情況，為基因挖掘提供了一種有效的手段[19].黃酮作為苦蕎中重要的活性成分物質(zhì)，因其具有抗氧化和降脂降糖的功效而成為研究熱點(diǎn).Yao等[20]分別對黑苦蕎麥和黃苦蕎麥的花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，檢測到差異表達(dá)基因數(shù)目為824個(gè)(上調(diào)表達(dá)191個(gè))，其中苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶和槲皮素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因具有較高的表達(dá)水平，而黃酮醇合成酶的編碼基因表達(dá)水平較低，這可能是造成苦蕎中蘆丁含量高而槲皮素含量較低的原因.盡管苦蕎耐貧瘠，抵抗干旱、鹽、紫外等能力較強(qiáng)，但之前對苦蕎耐逆性響應(yīng)機(jī)制卻少有報(bào)道.Zhu等[21]運(yùn)用Illumina測序平臺對50 μM鋁脅迫下0 h和6 h的“西蕎2號”根尖(0～2 cm)和基部(2～4 cm)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，苦蕎細(xì)胞壁毒性和氧化應(yīng)激防御的相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，且有機(jī)酸代謝并非鋁脅迫誘導(dǎo)有機(jī)酸分泌的限速步驟.本研究組也通過模擬脅迫的方式對苦蕎干旱和鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析(部分?jǐn)?shù)據(jù)未發(fā)表)，研究其耐逆性分子機(jī)理.如將苦蕎進(jìn)行200 mM NaCl的鹽脅迫處理，對其生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析，并運(yùn)用Illumina測序方法對鹽脅迫和對照的基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析，結(jié)果表明，編碼蛋白激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等與苦蕎鹽脅迫響應(yīng)有關(guān)[7].除黃酮物質(zhì)合成和逆境響應(yīng)等方面外，Zhang等[16]在苦蕎不同組織和不同發(fā)育階段均進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析工作，為進(jìn)一步明確苦蕎中關(guān)鍵基因的功能及分子改良提供了候選基因.

3 基因片段及相關(guān)分析

黃酮類物質(zhì)是苦蕎的主要活性成分，其生物合成代謝途徑中關(guān)鍵基因及調(diào)控因子是研究的重要內(nèi)容.目前，在模式植物中，黃酮類物質(zhì)的合成途徑已經(jīng)研究較為透徹，涉及查爾酮合成酶基因、4-香豆酸:輔酶A連接酶基因以及MYB和WD40等轉(zhuǎn)錄因子.苦蕎黃酮類物質(zhì)合成途徑的分析也主要圍繞上述關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子展開.Yao等[22]根據(jù)其他植物已知的WD40基因(擬南芥和玉米)設(shè)計(jì)簡并引物，結(jié)合RACE的方法，克隆得到了苦蕎FtWD40基因，其cDNA序列全長為1 097 bp，ORF長度為1 035 bp，編碼344個(gè)氨基酸.qRT-PCR結(jié)果表明，F(xiàn)tWD40在苦蕎花中表達(dá)量最高，與花青素含量相一致；同時(shí)，F(xiàn)tWD40在ABA、低溫、紫外UV-B等脅迫下表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá).酵母雜交實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)tWD40具有轉(zhuǎn)錄激活活性.將該基因重組到表達(dá)載體pCAMBIA1301，并導(dǎo)入煙草中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果表明，超表達(dá)FtWD40的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)為花青素含量增加，花瓣顏色加深；同時(shí)，二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)和花色素苷合酶(ANS)基因表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，而黃酮醇合酶(FLS)基因的表達(dá)水平降低.Zhang等[23]結(jié)合苦蕎基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對苦蕎中受茉莉酸調(diào)控的R2R3類型MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行挖掘，運(yùn)用酵母單雜交、酵母雙雜交和Western blot等對其調(diào)控蘆丁合成的分子機(jī)制進(jìn)行研究.結(jié)果表明，F(xiàn)tMYB13、FtMYB14、FtMYB15和FtMYB16均定位于細(xì)胞核；在蛋白水平上，F(xiàn)tMYB13、FtMYB14和FtMYB15均受茉莉酸誘導(dǎo)降解，從而直接抑制苦蕎蘆丁合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá).同時(shí)，F(xiàn)tSAD2和FtJAZ1能夠顯著促進(jìn)FtMYBs的抑制子活性.Zhou等[24]利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證了FtMYB11可與SAD2和FtJAZ1相互作用，其通過與FtSAD2或FtJAZ1相互作用來抑制苯丙烷類生物合成.此外，F(xiàn)tMYB中保守序列SID中的天冬氨酸起到關(guān)鍵作用，其突變能夠影響FtMYB11亞細(xì)胞定位和與SAD2的相互作用.

此外，在苦蕎逆境脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因挖掘方面，Zhou等[25]通過克隆得到了一個(gè)含有516 bp開放閱讀框的FtMYB12基因，其定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄激活活性.熒光定量結(jié)果表明，F(xiàn)tMYB12在莖中表達(dá)最高；冷脅迫下，其表達(dá)量顯著增加.FtMYB12轉(zhuǎn)基因擬南芥耐寒性增強(qiáng)，且該過程與COR15a基因表達(dá)相關(guān).同時(shí)，研究也表明，F(xiàn)tMYB9等苦蕎MYB家族基因通過調(diào)節(jié)不同的應(yīng)激反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑在鹽和耐旱性中起積極作用.

4 結(jié) 語

作為藥食同源的作物，苦蕎在品種選育、栽培技術(shù)、活性成分以及食品加工等各方面均取得了較大研究進(jìn)展.在苦蕎分子生物學(xué)的研究方面，苦蕎全基因組數(shù)據(jù)和多種轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果豐富了其遺傳資源，為進(jìn)一步推動(dòng)其分子生物學(xué)研究提供了重要數(shù)據(jù)，為苦蕎黃酮類活性成分調(diào)控和響應(yīng)逆境脅迫等關(guān)鍵基因的挖掘提供了參考.目前，關(guān)于苦蕎分子生物學(xué)的研究仍存在諸多問題，例如：對苦蕎脫殼、產(chǎn)量和黃酮等關(guān)鍵性狀的QTLs位點(diǎn)挖掘，并應(yīng)用于現(xiàn)有品種改良；如何將現(xiàn)有豐富的苦蕎基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析和利用等.針對這些問題，建議未來苦蕎分子生物學(xué)的研究主要圍繞3個(gè)方面進(jìn)行：其一是，針對苦蕎優(yōu)良基因型的品種，構(gòu)建可行的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，運(yùn)用其對苦蕎功能基因進(jìn)行深入研究和轉(zhuǎn)基因品種培育，并建立苦蕎基因編輯技術(shù)CRISPR，將其應(yīng)用于苦蕎研究中；其二是，將苦蕎基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，建立苦蕎綜合數(shù)據(jù)庫，基于基因組數(shù)據(jù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)手段，對黃酮類活性成分含量、脫殼、耐逆等優(yōu)良性狀相關(guān)的QTLs位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究；其三是，基于關(guān)鍵基因的挖掘和調(diào)控通路的機(jī)理解析，運(yùn)用生物化學(xué)方法和田間管理等手段對苦蕎關(guān)鍵性狀進(jìn)行調(diào)控，從而為苦蕎栽培和產(chǎn)品加工等提供理論基礎(chǔ).