胡惠清 李 靜 方 坤 盧彩紅 呂保先 龍劍文

（1.湖北省武漢市第九醫(yī)院，湖北 武漢 438000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢430061）

銀屑病是一種復(fù)雜的炎癥性皮膚病，其中涉及到炎癥細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用［1］。銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞存在過度增殖和角化不全等現(xiàn)象，是一種表現(xiàn)為表皮動力學(xué)紊亂為特征的慢性炎癥［2］。人磷酸化磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于細(xì)胞的增殖和抗凋亡起著至關(guān)重要的作用［3-4］。既往的研究表明PI3K-AKT通路在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖中發(fā)揮重要作用，異常的角質(zhì)形成細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過啟動PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的過度增殖，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡，對維持細(xì)胞高增殖的生物學(xué)特性發(fā)揮了重要作用［5］。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、解痙、降血壓、增強免疫功能及廣譜抗菌作用等［6］。本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，研究了不同濃度蛇床子素對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株 （HaCaT細(xì)胞）細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及對PI3K-AKT通路的調(diào)控和下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇床子素粉劑購于美國Sigma公司。HaCaT細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑和儀器

100 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素購自武漢博士德生物公司；DMEM干粉、小牛血清和胰蛋白酶購自GIBCO公司，CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司。分光光度儀為芬蘭雷勃公司產(chǎn)品 （Multiskan MS，Labsystems Oy，Helsinki， Finland）； 細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國熱電，3111型）。二甲基亞砜（DMSO，沈陽化學(xué)試劑廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的試驗 將培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的DMEM，待細(xì)胞長至60%～70%融合狀態(tài)時，加以處理因素，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分組為：60 μg/mL 蛇床子素處理組，40 μg/mL蛇床子素處理組，20 μg/mL蛇床子素處理組和正常對照組，每組均設(shè)6個平行孔，實驗均重復(fù)3次，常規(guī)培養(yǎng)48 h。各處理組待測樣品用DMSO溶解，用DMEM培養(yǎng)液稀釋，DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%，每組蛇床子素終質(zhì)量濃度分別為60、40、20 μg/mL。正常對照組每孔加入與處理組等體積的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，各組加入CCK-8 10 μL，待培養(yǎng)液顯色后，用酶標(biāo)儀測各孔450 nm波長的吸光度A值，以細(xì)胞的存活率表示細(xì)胞的增殖程度。細(xì)胞的存活率（%）=［（A1-A3）÷（A2-A3）］ × 100%。 A1：試驗組；A2：對照組；A3：只含有培養(yǎng)基和CCK-8的空白組。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)，分組同“1.3.1”項下方法。各組HaCaT細(xì)胞處理后，消化，洗滌，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，冰浴避光中操作如下：采用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，使其濃度為5×104/mL，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.3.4 Hoechst33258熒光法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 取對數(shù)期細(xì)胞消化制備活細(xì)胞懸液，按每孔5×104/L接種于預(yù)先置入玻璃蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)24 h，試驗分組和處理同“1.3.1”項下方法，孵育48 h后，吸盡培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗滌細(xì)胞，Hoechst 33258染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 Western blotting檢測 實驗分組和處理同“1.3.1”項下方法，每個濃度均設(shè)6孔，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)后的HaCaT細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加一抗，多克隆兔抗PI3K（1∶1 500，Cell Signaling Technology，Inc，#4255）； 多克隆兔抗 p-PI3K （tyr458，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4228S）；多克隆兔抗 AKT（1∶1 1000，Cell Signaling Technology，Inc，#9272）； 多克隆兔抗 p-AKT（ser473，1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#4060）；單克隆兔抗 Bcl-2（1∶1000，CellSignalingTechnology，Inc，#4223）；單克隆兔抗 Bax （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#5023）， 單克隆兔抗 Cleaved-caspase3 （1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc，#9664），4 ℃ 過 夜 ；PBS洗膜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（上海興悠生物科技有限公司）1∶5 000稀釋后孵育0.5 h；洗膜后用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測 （ECL，Amersham Biosciences公司）。結(jié)果掃描后，用Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析，以 β-actin（Santa Cruz，1∶200）為內(nèi)參校正。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩個獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK-q法進(jìn)行處理。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞增殖作用的影響

在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蛇床子素對HaCaT細(xì)胞的增殖有抑制作用（圖1C）。不同質(zhì)量濃度藥物處理組分別培養(yǎng) 48 h 后，60 μg/mL 組、40 μg/mL 組、20 μg/mL組與正常對照組比較，HaCaT細(xì)胞增殖有顯著差異（P＜0.05），且3個處理組組間比較，HaCaT細(xì)胞增殖也有顯著差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明蛇床子素能質(zhì)量濃度依賴性地抑制HaCaT細(xì)胞增殖。

2.2 不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinV/PI雙 染 法 結(jié) 果 顯 示 ，60 μg/mL 組 、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組HaCaT 細(xì)胞凋亡較正常對照組顯著增加（P＜0.05）；且3個處理組組間比較，Ha-CaT細(xì)胞凋亡也有顯著差異（P＜0.05）。由此可見，蛇床子素對HaCaT細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。見圖1A和1D。

2.3 各組HaCaT細(xì)胞凋亡形態(tài)比較

經(jīng)Hoechst染色后，正常對照組中的HaCaT細(xì)胞大而飽滿，呈均勻藍(lán)色熒光；在不同質(zhì)量濃度蛇床子素處理組中細(xì)胞核可見濃染致密的顆粒熒光，細(xì)胞縮??；隨蛇床子素質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，高倍鏡下可觀察到細(xì)胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質(zhì)濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質(zhì)邊集。見圖1B。

圖1 各組HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡比較

2.4 不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase3 表達(dá)的影響

蛇床子素對HaCaT細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有抑制作用，對促凋亡蛋白Bax，Cleaved-caspase3的表達(dá)有促進(jìn)作用（圖2A和2B）。與正常對照組比較，蛇床子素 60 μg/mL 組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對HaCaT細(xì)胞Bcl-2表達(dá)有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細(xì)胞Bcl-2表達(dá)抑制作用有顯著性差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細(xì)胞 Bax表達(dá)有促進(jìn)作用 （P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細(xì)胞Bax表達(dá)蛋白的促進(jìn)作用有顯著差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較， 蛇床子素 60 μg/mL組、40 μg/mL組、20 μg/mL組對HaCaT細(xì)胞Cleaved-caspase3表達(dá)有促進(jìn)作用 （P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細(xì)胞Cleaved-caspase3表達(dá)蛋白的促進(jìn)作用有顯著性差異（均P＜0.05）。

圖2 不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞PI3K-AKT通路及下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞AKT，p-AKT，PI3K，p-PI3K 表達(dá)的影響

蛇床子素處理對 HaCaT細(xì)胞 AKT，PI3K蛋白表達(dá)無明顯影響，但對p-AKT，p-PI3K的表達(dá)有明顯抑制作用（圖2C和2D）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細(xì)胞p-PI3K表達(dá)均有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細(xì)胞表達(dá)p-PI3K抑制作用有顯著性差異 （均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL 組、20 μg/mL 組對 HaCaT 細(xì)胞 p-AKT 表達(dá)均有抑制作用（P＜0.05），且各處理組間對HaCaT細(xì)胞p-AKT表達(dá)抑制作用有顯著性差異（均P＜0.05）。與正常對照組比較，蛇床子素60 μg/mL組、40 μg/mL組、20 μg/mL組對HaCaT細(xì)胞AKT和PI3K蛋白表達(dá)無顯著性差異（均P＞0.05）。

3 討 論

角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是尋常型銀屑病的主要病理特征之一?，F(xiàn)代研究表明磷脂酰肌醇3激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞存活的重要通路［7］，廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝和腫瘤侵襲等多個生物學(xué)過程，在維持細(xì)胞生長、增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-10］。Akt是PI3K信號通路下游直接的靶蛋白，也稱為蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［11］，有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損中PI3K基因及其亞單位PI3K蛋白的表達(dá)特異性增高［12］。也有研究表明銀屑病患者皮損內(nèi)p-Akt的蛋白水平明顯高于正常皮膚［13］，Akt活性增強可引起角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖和真皮乳頭血管增生［14］。而且AKT的活化可以調(diào)控下游Bax、Bcl-2的表達(dá)和功能，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖［15］。

在以前的研究中，蛇床子素能抑制部分腫瘤細(xì)胞的增殖［16］，前期研究也發(fā)現(xiàn)蛇床子素能抑制HaCaT細(xì)胞增殖［17］。但具體機制尚不清楚。在本研究中，筆者觀察了不同質(zhì)量濃度蛇床子素對HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對PI3K-AKT通路和相關(guān)的下游蛋白進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，蛇床子素能抑制HaCaT細(xì)胞增殖和促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡，此外，筆者還發(fā)現(xiàn)蛇床子素能抑制PI3K和AKT蛋白的磷酸化，并上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果，筆者認(rèn)為蛇床子素可能通過抑制PI3K-AKT通路的活化，進(jìn)而上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制HaCaT細(xì)胞增殖和促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡。盡管HaCaT細(xì)胞并不完全等同于銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞，但是在銀屑病中，蛇床子素仍然有可能產(chǎn)生類似的效應(yīng)。本研究為中藥蛇床子治療銀屑病提供了一定的依據(jù)。