李小一 ,劉美岐,竇啟航，劉雅琦，韓 偉

(華東理工大學(xué)藥學(xué)院制藥工程與過(guò)程化學(xué)教育部工程研究中心；華東理工大學(xué)藥學(xué)院上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

1 蛹蟲草簡(jiǎn)介

蛹蟲草Cordyceps militaris，又名北冬蟲夏草，是麥角菌科蟲草屬真菌的模式種，由子實(shí)體與菌核兩部分組成的復(fù)合體。《新華本草綱要》記載其“味甘，性平，益肺腎，補(bǔ)精髓，止血化痰”，是一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥。研究表明[1]蛹蟲草富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理活性，廣泛用于腫瘤、免疫功能低下，包括艾滋病毒感染等多種疾病中。蟲草多糖為其主要有效成分之一，本文論述了從蛹蟲草中提取分離蛹蟲草多糖的方法，以期為其藥理研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

2 蛹蟲草的有效成分及藥理作用

2.1 蛋白質(zhì)及氨基酸類

蛹蟲草富含蛋白質(zhì)(含量為39.37%)，是羊肉蛋白質(zhì)含量的1.9倍，包含18種氨基酸，其中人體所必需的氨基酸有8種，且比例適當(dāng)，其中，谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，谷氨酸可以參與腦內(nèi)蛋白質(zhì)和糖的代謝，促進(jìn)氧化過(guò)程，使血氨下降，減輕肝昏迷癥狀，還可以治療如精神分裂癥以及因腦血管障礙引起的記憶和語(yǔ)言障礙和小兒智力不全等。天冬氨酸可作為K+、Mg2+離子的載體向心肌輸送電解質(zhì)，由此來(lái)改善心肌功能，降低氧耗，治療心臟病，高血壓，降低血液中氮和二氧化碳含量，消除疲勞。

2.2 蟲草多糖

2.2.1 抗腫瘤

Jayakumar等通過(guò)研究檢測(cè)到從蟲草中提取的多糖CME-1有抗癌作用，能導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinase,MMP)的表達(dá)水平降低，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移[2]。很多研究都表明蟲草多糖的抗癌作用不是直接殺傷癌細(xì)胞，而是通過(guò)調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)從而實(shí)現(xiàn)抗癌效果。

2.2.2 免疫調(diào)節(jié)作用

蟲草多糖可以對(duì)免疫細(xì)胞和免疫分子產(chǎn)生不同程度的影響，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而產(chǎn)生免疫活性分子，對(duì)人體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。同時(shí)，還可以結(jié)合紅細(xì)胞膜上的受體，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。蛹蟲草基質(zhì)多糖可以促進(jìn)動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，從而提高動(dòng)物機(jī)體的免疫能力。

2.2.3 降低血糖

蛹蟲草多糖可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖值，并且可以降低糖化血紅蛋白和糖化血清蛋白含量。胰腺組織細(xì)胞的抗氧化能力很低，氧化應(yīng)激會(huì)損傷胰島β細(xì)胞，降低合成分泌胰島素的能力，因此其對(duì)自由基的損傷非常敏感，而蛹蟲草多糖可以提高機(jī)體及胰腺的抗氧化能力，從而保護(hù)胰島β細(xì)胞，具有良好的降低血糖的作用。

2.3 蟲草素

蟲草素是從蛹蟲草中提取的一種核苷類抗生素，可以抗菌、抗炎、抗病毒，對(duì)枯草桿菌、牛結(jié)核分歧桿菌有很好的抑制作用，同時(shí)也可以抑制病毒mRNA的翻譯過(guò)程從而達(dá)到抵抗病毒增殖的目的。有關(guān)研究也表明蟲草素可以通過(guò)作用于多種信號(hào)通路，通過(guò)各種途徑間的協(xié)同作用同時(shí)抑制腎臟纖維化的進(jìn)程[3]。另外，蟲草素在神經(jīng)系統(tǒng)方面也有一定的藥理作用，可以鎮(zhèn)靜催眠并且改善學(xué)習(xí)記憶。

2.4 SOD

蛹蟲草中還含有SOD，這是好氧生物細(xì)胞防衛(wèi)系統(tǒng)中非常重要的一種抗氧化酶，它可以防止超氧陰離子對(duì)細(xì)胞的損傷，具有調(diào)節(jié)血脂的保健作用，預(yù)防高血脂引起的心腦血管疾病。除此之外SOD還能抗衰老、防輻射、抗疲勞，對(duì)糖尿病有明顯的恢復(fù)作用。

2.5 微量元素

蛹蟲草對(duì)微量元素有明顯的富集作用，共含20多種礦物元素。其中微量元素鋅可參與多種酶的合成，和很多基礎(chǔ)生理活動(dòng)都息息相關(guān)，是人體多種蛋白的組成成分；而硒可以和人體內(nèi)的酶結(jié)合生成具有強(qiáng)抗氧化能力的活性物質(zhì)，從而增強(qiáng)免疫能力，而且硒不能簡(jiǎn)單的通過(guò)人體直接吸收，需要如蛹蟲草這樣的生物通過(guò)轉(zhuǎn)換變?yōu)橛袡C(jī)硒再攝入。

3 蛹蟲草多糖的提取

3.1 傳統(tǒng)提取方法

3.1.1 煎煮法

煎煮法，即熱水浸提法，是傳統(tǒng)中藥有效成分提取的最常見最簡(jiǎn)易的工序，其主要工作原理是利用高溫溶劑破壞藥材細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使有效成分充分溶解于溶劑中，包括先煎、包煎、另煎、后煎、兌服等煎煮方法，具有操作簡(jiǎn)便，適用范圍廣，溶劑廉價(jià)易得等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，煎煮法也具有存放時(shí)間短，產(chǎn)物雜質(zhì)多等缺點(diǎn)。

3.1.2 回流法

回流法，指用水、乙醇等溶劑揮發(fā)浸提中藥中的有效成分，溶劑餾出后經(jīng)過(guò)冷凝回流裝置回到溶液中反復(fù)浸提藥材，直至有效成分完全提出。回流法包括水熱回流法，醇熱回流法，回流冷浸法等。該方法易于控溫，溶劑消耗少，操作簡(jiǎn)單，具有相當(dāng)多的優(yōu)越性。

3.2 現(xiàn)代提取方法

3.2.1 酶法提取

酶法提取，即利用酶的高效性和選擇性，對(duì)中藥進(jìn)行處理，通過(guò)破壞中藥細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等手段獲得中藥中的有效成分。酶法提取需要選擇適宜的酶的類型，以分解蛹蟲草細(xì)胞的纖維素、蛋白質(zhì)等成分，提高有效成分溶出效率。酶法提取具有專一性，高效性和反應(yīng)條件溫和性，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，優(yōu)化提取過(guò)程。

汪振炯等[4]在微波協(xié)同酶法提取蛹蟲草多糖的研究中，獲得了最佳提取工藝參數(shù)，即在料液比1∶30，纖維素酶量1650U/g，提取溫度55℃，pH值=5.5條件下，酶解處理44min后進(jìn)行微波提取，微波功率控制在480W，提取時(shí)間3.5min，多糖得率為18.45%。

3.2.2 微波輔助提取

微波輔助提取，指中藥和溶劑中的偶極分子在微波的作用下獲取能量，在短時(shí)間內(nèi)放出大量熱能，以獲得中藥有效成分的工藝，該工藝穿透性強(qiáng)，選擇性高，簡(jiǎn)便快速，可輔助其他提取技術(shù)共同進(jìn)行，改良傳統(tǒng)提取技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，且節(jié)約溶劑，萃取率高，成本低，對(duì)提高有效成分的提取率作用明顯。

3.2.3 亞臨界水浸提法

亞臨界水浸提法是指用100～374℃的液態(tài)水對(duì)中藥的有效成分進(jìn)行浸提的方法。原理是在一定壓力下，升高溫度使水維持在液體狀態(tài)，并改變其表面張力、黏度、極性等。

4 蛹蟲草多糖的純化

4.1 傳統(tǒng)純化方法

4.1.1 醇沉法

醇沉法是一種向中藥提取濃縮液內(nèi)添加乙醇，使低分子有效成分溶于醇溶液中，而高分子雜質(zhì)被析出成為沉淀，固液分離后使提取液得以精制的傳統(tǒng)純化方法。

該方法可用于蛹蟲草多糖的提取，產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)。

4.1.2 結(jié)晶和重結(jié)晶

結(jié)晶和重結(jié)晶的方法是一種使用溶劑從過(guò)飽和溶液中分離提純?nèi)芙舛炔煌募兓镔|(zhì)和雜質(zhì)，使全部或大部分雜質(zhì)去除的傳統(tǒng)的凈化方法，從而達(dá)到分離純化的目的。

該方法工藝操作性強(qiáng)，最大限度地提高了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

4.1.3 溶劑萃取法

溶劑萃取法為一種利用在兩種互不相溶(或微溶)的溶劑中某一化合物的分配系數(shù)或溶解度不同，將化合物從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間快、生產(chǎn)周期短、萃取效果好等優(yōu)點(diǎn)，采用多級(jí)萃取時(shí)，溶質(zhì)濃縮倍數(shù)大、純化度高。

4.2 新型純化方法

4.2.1 離子交換樹脂

離子交換樹脂是一種為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒物，帶有交換離子的活性基團(tuán)，具有不溶性。離子交換樹脂離解后，本體所含的負(fù)/正電基團(tuán)能吸附結(jié)合溶液中的其他陽(yáng)/陰離子，從而達(dá)到純化目的。

該方法吸附能力強(qiáng)，應(yīng)用范圍較廣，在低溫常壓下可很有效的脫附，脫附后經(jīng)簡(jiǎn)單的處理就可再生，以達(dá)到循環(huán)使用和控制污染的目的,但該法選擇性差，樹脂的粘度較小，需較細(xì)的篩分。

4.2.2 色譜分離

色譜分離法是一種利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相體系中具不同分配系數(shù)，當(dāng)兩相彼此相對(duì)移動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)，反復(fù)多次分配后各物質(zhì)可達(dá)到分離目的的方法。

該方法適用范圍廣、分離效率高、分析速度快、樣品消耗小、靈敏度高、易于自動(dòng)化，可在工業(yè)流程中使用。

4.2.3 大孔吸附樹脂分離

大孔吸附樹脂是一種性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)高分子吸附劑，不同于離子交換樹脂，不含離子交換基團(tuán)，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，可吸附和篩選有機(jī)物質(zhì)，不易受離子干擾。不同極性和孔徑的樹脂對(duì)不同化合物的選擇性不同，從而可以達(dá)到分離純化的目的。大孔吸附樹脂法是目前最常用的純化方法之一，包括吸附和解吸，所用溶劑主要為水及乙醇，且其工藝簡(jiǎn)單，無(wú)污染，效率高[5]。

林俊芳等[6]公開的純化工藝中，蛹蟲草多糖經(jīng)強(qiáng)極性大孔吸附樹脂純化后，可測(cè)得其脫色率為85.94%，蛋白去除率為70.05%，多糖保留率為78.92%。此外，經(jīng)處理后，蛹蟲草多糖樣品中多糖并未發(fā)生任何結(jié)構(gòu)改變，其抗氧化作用明顯高于傳統(tǒng)處理方法，同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，安全性高，且該方法純化工藝簡(jiǎn)單，成本低，吸附劑安全、環(huán)保，適用于工業(yè)上進(jìn)行批量生產(chǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)

冬蟲夏草因其滋補(bǔ)功效及藥理價(jià)值而價(jià)格高昂，蛹蟲草與之成分相近，因可以人工培育而相對(duì)價(jià)格低廉，可能成為冬蟲夏草的替代藥物。因此，近年來(lái)蛹蟲草多糖的提取分離方法正逐漸受到重視，而傳統(tǒng)的提取方法因提取效率低、溶劑消耗大、耗時(shí)長(zhǎng)、有效成分流失大等缺點(diǎn)已經(jīng)難以滿足生產(chǎn)發(fā)展需求。隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展，中藥研究方法不斷突破創(chuàng)新，取得了一系列研究成果。新型提取技術(shù)如超聲提取、微波提取、酶法提取、大孔樹脂分離等提取分離技術(shù)大大提高了效率，促進(jìn)了中藥研究的發(fā)展，也為中藥工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。但其高技術(shù)要求也帶來(lái)了一定阻礙，如高成本、操作難度高、難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)等。如何發(fā)揮舊方法的優(yōu)點(diǎn)，與新方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果投入工業(yè)化生產(chǎn)中，還需要進(jìn)一步探索和研究。