喻運珍,余少梅,張立強,李 娟,鄧 平,羅楊志,高銀愛,丁運敏

（1.武漢市農業(yè)科學院，武漢430207；2.武漢中博水產生物技術有限公司，武漢430207；3.湖北中醫(yī)藥大學，武漢430065；4.武漢市武湖農業(yè)發(fā)展有限公司，武漢430334）

穿梅三黃散是由大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅五味藥材粉碎加工而成的，具有清熱解毒功能，用于治療魚類細菌性敗血癥、腸炎、爛鰓與赤皮病[1]。通常產品是經(jīng)普通粉碎，粉末粒度在80～120目（150～180μm）之間。中草藥極細粉粉末粒度在一般在150目（90μm）在200目（75μm）之間[2]。超微粉一般指細胞級微粉，利用機械或流體動力方法，將3 mm以上的中草藥顆粒，加工成30μm以下粒徑的粉散劑，一般粒徑為5～47μm，細胞破壁率達95%以上。與傳統(tǒng)粉散劑比較，中草藥超微粉具有有效成分釋放快、生物利用率高、臨床作用效果顯著等特點[3]。研究以穿梅三黃散為研究對象，比較了1000目超微粉和200目極細粉之間顯微特征及藥效學差異，旨在為穿梅三黃散超微粉應用提供試驗數(shù)據(jù)參考。

1 材 料

1.1 藥材 大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅，均購自安徽旭松中藥飲片有限公司，經(jīng)公司質檢部門按照《中華人民共和國獸藥典2015年版二部》鑒定合格。穿梅三黃散由以上5種藥材按比例粉碎混合而成，穿梅三黃散超微粉，委托山東埃爾派粉體科技股份有限公司生產，過1000目篩；穿梅三黃散極細粉為本公司自行粉碎生產，過200目篩。

1.2 菌株 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）和腸型點狀氣單胞菌（Aromonas punctata f.intestinalis）為實驗室保存菌種。

1.3 試驗動物 草魚，購置于江夏山坡某養(yǎng)殖戶，50±5 g，置于網(wǎng)箱中暫養(yǎng)一周。

1.4 試驗試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和Shieh營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.5 主要儀器 BM1000生物顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；JFC－1600真空離子濺射鍍膜儀、JSM－6510LV掃描電鏡（日本電子公司）；Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；2HP－100生化培養(yǎng)箱（上海蘇進儀器設備廠）。

2 方 法

2.1 顯微觀察 生物顯微鏡觀察:取少量粉末，水合氯醛透化，于生物顯微鏡下觀察粉末特點[4]。

電鏡觀察:取適量樣品，用導電銀膠粘在樣品臺上，經(jīng)鍍膜儀噴金后，于掃描電子顯微鏡下觀察[5]。

2.2 抑菌試驗[6－7]

2.2.1 菌液配制 將嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌和腸型點狀氣單胞菌分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液配制成0.5麥氏濁度的菌液備用。將柱狀黃桿菌接種于Shieh營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液配制成0.5麥氏濁度的菌液備用。

2.2.2 藥液配制 采用倍比稀釋法。將穿梅三黃散紫外照射滅菌后，用無菌水配制768 mg/mL母液。取9支滅菌試管，第1管中加入5 mL肉湯培養(yǎng)基，2～8管加入3 mL；取1 mL母液至第1管中，混勻后吸取3 mL至第2管，混勻吸取3 mL至第3管，依次類推至第7管，混勻后，吸取3 mL棄去。1 ～7管穿梅三黃散濃度分別為 128，64、32、16、8、4、2 mg/mL。第8管為肉湯對照，第9管為藥液對照。

2.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 分別吸取100μL菌液加至1～8管中，28℃培養(yǎng)24 h后觀察，沒有細菌生長的最小濃度為最小抑菌濃度（MIC）。每種試驗藥物設3組平行，MIC結果取其平均值。

2.3 飼喂試驗

2.3.1 試驗分組及處理 試驗在2 m×2 m×1.5 m網(wǎng)箱中進行，分為三組，對照組、超微粉組和極細粉組，每組投放30尾草魚。對照組投喂普通市售飼料，用藥組投喂拌藥飼料，飼料添加量為20 g/kg，每日投喂3次，連續(xù)投喂10 d。

2.3.2 樣品采集及指標測定[8]試驗結束時，每組取草魚6尾，尾靜脈采血，4℃下靜置1 h后3000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取肝臟制成10%組織勻漿。血清用于測定谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）含量；肝組織勻漿用于測定過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）含量。 AST、ALT采用自動生化測定儀進行測定，組織中CAT、MDA、SOD、GSH－PX采用南京建成試劑盒測定。

3 結果與分析

3.1 顯微觀察 穿梅三黃散極細粉在生物顯微鏡下可以觀察到五味藥材的各種特有特征（圖1ag），而超微粉幾乎觀察不到任何細胞形態(tài)（圖1h），其藥物特有的特征均消失。

在掃描電鏡下可以觀察到，穿梅三黃散超微粉（圖2b）粉體粒徑更小，粒徑分布更加均勻。

圖1 穿梅三黃散超微粉和極細粉普通顯微鏡觀察（×100）Fig 1 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by microscope（ ×100）

圖2 穿梅三黃散超微粉和極細粉掃描電鏡觀察Fig 2 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by scanning electron microscope

3.2 抑菌試驗 由表1可以看出，穿梅三黃散超微粉和極細粉對嗜水氣單胞菌的MIC分別為32和64 mg/mL，柱狀黃桿菌為32和64 mg/mL，腸型點狀氣單胞菌為8和32 mg/mL，超微粉對各致病菌的MIC均小于極細粉，其中對嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌的MIC是極細粉的1/2，對腸型點狀氣單胞菌的MIC是極細粉的1/4。說明穿梅三黃散超微粉浸出液對3種致病菌的抑菌效果優(yōu)于極細粉。

表1 穿梅三黃散超微粉和極細粉對3株細菌的最小抑菌濃度（MIC）Tab 1 MIC of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on three bacteria

3.3 飼喂試驗 由表2及表3可以看出，拌飼投喂穿梅三黃散后，血清中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉組小于極細粉組，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），表明飼喂穿梅三黃散能夠降低試驗草魚血液中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）酶活性及肝組織中丙二醛（MDA）含量。

過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉組顯著高于極細粉組（P＜0.05），表明飼喂穿梅三黃散能夠提高試驗草魚肝組織中過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）酶活性。

表2 穿梅三黃散超微粉和極細粉對血清中AST和ALT影響Tab 2 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on AST and ALT in serum

表3 穿梅三黃散超微粉和極細粉對肝臟組織中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的影響Tab 3 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on liver tissue SOD，CAT，GSH-Px，MDA

4 討論與結論

穿梅三黃散超微粉對3種魚類致病菌的最小抑菌濃度均小于極細粉，抑菌作用顯著優(yōu)于極細粉。這是因為藥物粒子的大小和粉體的結構是影響藥物溶出度的重要因素。穿梅三黃散經(jīng)超微粉碎，粉碎更充分，粉末粒徑更?。▓D2），有效成分更易溶出。一般情況下，中草藥中有效成分需要經(jīng)過浸潤、溶脹、滲透和分散才能溶出，采用超微粉碎工藝消除阻力能夠加快溶出速率、溶出量[9]。蔡萍等研究發(fā)現(xiàn)，超微粉碎技術可以顯著加快五苓散中桂皮醛的體外溶出率[10]。張國祖等在研究中發(fā)現(xiàn)，在相同浸泡條件下，扶正解毒散超微粉中，淫羊藿苷的浸出量比普通粉平均提高了115%，水溶性浸出物提高了17%，總糖提高31%[11]。研究中，體外抑菌試驗間接反映了穿梅三黃散有效抑制菌成分溶出度高于極細粉，與以上研究結果一致。

谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）是肝細胞受到損傷的敏感指標，肝細胞受損時，血液中酶活性升高；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）是機體內重要的抗氧化酶，肝細胞受損時，酶活性降低；而丙二醛（MDA）是脂質過氧化的終產物，其含量變化間接反映了機體脂質過氧化水平和肝細胞損傷程度，肝細胞受到損傷時，丙二醛（MDA）含量升高[12]。研究中發(fā)現(xiàn)穿梅三黃散能夠降低谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）酶活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）酶活性，說明穿梅三黃散能夠改善魚類的肝臟狀況，提高肝臟抗損傷能力，其中超微粉作用效果優(yōu)于極細粉。

中草藥經(jīng)過細胞破壁后有效成分完全釋放出來，由于超微粉顆粒粒徑小，因此具有表面效應、體積效應等特性，對物質的吸附性増大，有利于畜禽機體對藥物的吸收利用，因而治療效果有質的飛躍[13]。顧建明等[14]研究發(fā)現(xiàn)，0.5%中藥超微粉能顯著促進肉雞免疫器官發(fā)育，提高機體免疫功能，且可達到1%中藥粗粉的效果。李榮譽等[15]分別觀察了三七、元胡、大黃超微粉對小白鼠的凝血、鎮(zhèn)痛和腸蠕動作用的影響，超微粉作用效果優(yōu)于普通粉，均得出本研究相似結論。

終上所述，穿梅三黃散超微粉能夠顯著提高抑菌能力及魚類肝臟抗損傷能力。由于大多數(shù)水生動物沒有胃，腸道相對較短，簡單粉碎的中草藥在水生動物體內留存時間短，利用率低，有的藥材有效成分還沒有釋放出來就被排出體外，造成極大的浪費。經(jīng)超微粉碎后，藥物粉體活性進一步增強，溶出率提高，有效成分能夠較快的進入魚體，發(fā)揮作用，藥效增強。因此，中草藥超微粉在水生動物疫病防治上具有很好的應用前景。