鄭朝朝,劉云濤,李倬,鄒立宏,郁宏偉*

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定071000；3.吉林省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局，長(zhǎng)春130062）

豬瘟病毒和豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)主要依靠兔體定型熱反應(yīng)方法（RID）[1]，試驗(yàn)成本較高、操作繁瑣、試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異和環(huán)境因素等多方面影響，檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確，造成疫苗成品質(zhì)量不穩(wěn)定[2－3]，甚至免疫失敗。

相關(guān)文獻(xiàn)中有很多關(guān)于免疫熒光檢測(cè)法（FA）[4]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[5－6]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）[7]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（Realtime PCR）[8－9]等檢測(cè)豬瘟活疫苗效力的報(bào)道[10]，但都有各自的缺陷，如不能有效區(qū)分活病毒與失活病毒、重復(fù)性差、操作復(fù)雜等，最終未能全面推廣。本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測(cè)豬瘟病毒含量及疫苗效力的間接免疫熒光法（IFA），以便能更加準(zhǔn)確評(píng)價(jià)豬瘟活疫苗效力和豬瘟半成品病毒含量，滿(mǎn)足規(guī)?；a(chǎn)的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 豬瘟抗體陽(yáng)性血清（一抗），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)2009002；FITC標(biāo)記的兔抗豬熒光抗體（二抗），購(gòu)自SIGMA公司，批號(hào)2015002；甲醇、丙酮、PB、氯化鉀、氯化鈉等試劑，均為分析純，購(gòu)自北京益利化學(xué)試劑公司。

1.1.2 細(xì)胞 豬睪丸細(xì)胞（ST），由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司種毒室提供。

1.1.3 樣品 瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司2013－2014年生產(chǎn)的豬瘟活疫苗成品20批、半成品90批。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng) 常規(guī)方法復(fù)蘇ST細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成良好單層后用0.25%胰酶消化分散，并用細(xì)胞生長(zhǎng)液重懸，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 效價(jià)檢測(cè)

1.2.2.1 兔體定型熱反應(yīng)檢測(cè) 按照國(guó)標(biāo)中豬瘟活疫苗效力檢驗(yàn)方法對(duì)被檢疫苗進(jìn)行稀釋?zhuān)肦ID法檢測(cè)被檢樣品的效力。

1.2.2.2 熒光檢測(cè) 倍比稀釋各被檢樣品，制備成不同稀釋度的病毒液備用。棄去96孔板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液，用0.01 mol/L的PBS沖洗一遍后將0.1 mL病毒液與PB液（1∶1）混勻加入96孔培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不加PB液的對(duì)照孔及陰性、陽(yáng)性對(duì)照孔。接毒后細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃孵育2.5 h，孵育結(jié)束后棄去病毒液，用0.01 mol/L的PBS沖洗一遍，補(bǔ)充維持液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，采用IFA法檢測(cè)樣品的TCID50。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取豬瘟活疫苗成品、半成品樣品各5批次，應(yīng)用本研究中建立的檢測(cè)方法和RID法進(jìn)行效力檢測(cè)，均重復(fù)兩次，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 與常規(guī)熒光檢測(cè)方法對(duì)比 本研究中IFA法檢測(cè)豬瘟病毒效力時(shí)加入了PB，明顯提高了豬瘟病毒對(duì)細(xì)胞的感染率:本法中樣品稀釋16000倍接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)3 d后，特異性熒光孔數(shù)多，單孔熒光廣泛（圖1），較常規(guī)免疫熒光法（圖2）明顯提高。PB單獨(dú)處理空白細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生特異性熒光（圖 3）。

圖1 本研究IFA檢測(cè)結(jié)果Fig 1 Results of IFA detection by this method

圖2 常規(guī)FA檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Conventional FA detection results

圖3 PB處理空白細(xì)胞IFA結(jié)果Fig 3 IFA results of blank cells treated with PB

2.2 與兔體定型熱反應(yīng)檢測(cè)法的相關(guān)性 通過(guò)對(duì)20個(gè)豬瘟活疫苗成品、90個(gè)豬瘟活疫苗半成品的效力檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得出了IFA法與RID法對(duì)應(yīng)關(guān)系圖（圖4和圖5）。

圖4顯示，兔體檢測(cè)7500 RID/mL的樣品，熒光檢測(cè)TCID50/0.1mL集中在28.8以上；兔體檢測(cè)1.5×104RID/mL的樣品 TCID50/0.1mL集中在28.8至29.8之間；兔體檢測(cè)3.0×104RID/mL的樣品TCID50/0.1mL集中在29.7以上。

圖5表明，兔體檢測(cè)1.0×105～3.0×105RID/mL的半成品樣品，TCID50/0.1mL集中在212.11以上，3.0×105～5.0×105RID/mL樣品TCID50/0.1mL集中在213.03至213.96；兔體檢測(cè)5.0×105～8.0×105RID/mL樣品，熒光檢測(cè) TCID50/0.1mL集中在213.34至214.46；兔體檢測(cè)8.0×105RID/mL以上合格樣品，熒光檢測(cè)TCID50/0.1mL集中在214.4以上。

圖4 成品檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Results of product

圖5 半成品檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Results of Semi-finished product

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用本研究IFA法和RID法分別對(duì)豬瘟活疫苗成品、半成品進(jìn)行效力檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)兩次檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 兩種方法檢測(cè)成品結(jié)果比較Tab 1 Results of product by two detection methods

表2 兩種方法檢測(cè)半成品結(jié)果比較Tab 2 Results of Semi-finished product by two detection methods

如表1所示，用IFA和RID兩種效力檢測(cè)方法對(duì)5個(gè)批次的成品進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，IFA法兩次結(jié)果復(fù)核率為100%，而RID法兩次結(jié)果復(fù)核率為80%。

如表2所示，用IFA和RID兩種效力檢測(cè)方法對(duì)5個(gè)批次的半成品進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，IFA法兩次結(jié)果復(fù)核率為100%，而 RID法兩次結(jié)果復(fù)核率為73%。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本研究中所建立的IFA法與RID法有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，能夠準(zhǔn)確、快速檢測(cè)豬瘟疫苗成品、半成品效力。

本研究所建立的IFA法較常規(guī)免疫熒光法敏感性更高，通過(guò)在病毒液中增加促細(xì)胞感染劑PB定向增加豬瘟病毒與寄主細(xì)胞接觸面積，從而提高了病毒對(duì)細(xì)胞的感染率，提高了疫苗檢測(cè)的敏感性。解決了常規(guī)免疫熒光法因細(xì)胞感染率不高所導(dǎo)致的不穩(wěn)定、重復(fù)性差的問(wèn)題，同時(shí)避免了RID法中因兔體差異、環(huán)境因素、操作繁復(fù)所造成的誤差。

本研究中IFA法的建立是以RID法為基礎(chǔ)，而檢測(cè)準(zhǔn)確度、可重復(fù)性高于RID法。如RID法檢測(cè)140703批成品疫苗時(shí)，出現(xiàn)了7500 RID/mL兩次檢測(cè)均不合格，而1.5×104、3.0×104RID/mL檢測(cè)均合格的情況；檢測(cè)半成品疫苗時(shí)，也多次出現(xiàn)了低倍數(shù)稀釋半成品疫苗效力檢驗(yàn)不合格，而高倍數(shù)稀釋效力檢驗(yàn)合格的情況。而IFA法檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確，兩次檢測(cè)結(jié)果復(fù)核率可達(dá)到100%。

本研究將IFA法應(yīng)用于檢測(cè)豬瘟活疫苗成品、半成品效力，理論上來(lái)說(shuō)其檢測(cè)結(jié)果（TCID50）與疫苗效力應(yīng)當(dāng)有良好的直線(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，但實(shí)際成品檢測(cè)結(jié)果各檢測(cè)梯度間TCID50相差不大，而半成品檢測(cè)結(jié)果中相鄰的檢測(cè)梯度間也有較大的重疊區(qū)，這可能是RID法檢測(cè)各樣品時(shí)并未檢測(cè)至終點(diǎn)（疫苗實(shí)際效力高于檢測(cè)值），導(dǎo)致與之對(duì)應(yīng)的TCID50偏高。因此本研究仍需要更多數(shù)據(jù)建立IFA檢測(cè)結(jié)果與疫苗實(shí)際效力的直線(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。