楊 星,馬秋冉,董玲玲,趙富華,于曉輝

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

伊維菌素吡喹酮咀嚼片是“十二五”國家科技支撐計劃項目研制的新制劑，是由伊維菌素、吡喹酮和賦形劑制成的咀嚼片，用于寵物犬體內(nèi)外寄生蟲的治療[1]。伊維菌素[2]是大環(huán)內(nèi)酯類體內(nèi)外驅(qū)蟲藥，對絲蟲、鉤蟲、圓蟲、鞭蟲、蛔蟲等具有效果；吡喹酮[3]對動物體內(nèi)線蟲、吸蟲、絳蟲有效。通過兩種藥物組合，擴大驅(qū)蟲譜，可提高一次性驅(qū)蟲效果。

溶出度試驗技術(shù)是評價口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的一種重要手段[4]，為有效控制伊維菌素吡喹酮咀嚼片的質(zhì)量，需建立相應(yīng)的溶出度測定方法。本文參考《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]及相關(guān)文獻(xiàn)[6－8]，建立了同時測定伊維菌素與吡喹酮的溶出度方法。

1 材 料

1.1 儀器 高效液相色譜儀－二極管陣列檢測器（Waters e2695 2998，Empower2色譜工作站軟件）；分析天平（梅特勒XS 205，十萬分之一）；RCZ－8B溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試藥 伊維菌素對照品（含量:91.0%，批號:K0191406，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；吡喹酮對照品（含量:99.7%，批號:100046－201205，中國食品藥品檢定研究院）；伊維菌素吡喹酮咀嚼片3批（批號:20170501、20170502、20170503，規(guī)格:伊維菌素2 mg與吡喹酮50 mg，生產(chǎn)企業(yè):東方澳龍制藥有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水（超純水），十二烷基硫酸鈉（Merck），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent XDB －C18，75 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；以水為流動相A，乙腈為流動相B，照表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量:伊維菌素50μL，吡喹酮20μL；柱溫為30℃；伊維菌素檢測波長為245 nm，吡喹酮檢測波長為210 nm。伊維菌素H2B1a與H2B1b峰的分離度應(yīng)符合要求。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Procedure of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取本品，照溶出度測定法（《中國獸藥典》2015年版一部附錄 0931，第二法），以含0.2%十二烷基硫酸鈉（SDS）的磷酸二氫鈉溶液500 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/min，依法操作，在45 min時，取溶液適量，濾過，取續(xù)濾液，作為伊維菌素供試品溶液；精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度并搖勻，作為吡喹酮供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 取伊維菌素對照品20 mg，吡喹酮對照品50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度并搖勻，制成每1 mL中含伊維菌素4μg和吡喹酮10μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 溶出介質(zhì) 含0.2%SDS的pH1.0鹽酸溶液的配制:取鹽酸9.0 mL與SDS 2.0 g，加水使溶解并稀釋至1000 mL；含0.2%SDS的pH4.0醋酸鹽緩沖液的配制:取2 mol/L醋酸溶液20.5 mL、醋酸鈉1.22 g與SDS 2.0 g，加水使溶解并稀釋至1000 mL；含0.2%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液的配制:取無水磷酸二氫鈉1.2 g與SDS 2.0 g，加水1000 mL使溶解，用飽和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0；含0.05%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液的配制:取無水磷酸二氫鈉1.2 g與SDS 0.5 g，加水1000 mL使溶解，用飽和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0；含0.1%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液的配制:取無水磷酸二氫鈉1.2 g與SDS 1.0 g，加水1000 mL使溶解，用飽和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0。

2.3 溶出方法的確定

2.3.1 溶出裝置的選擇 首選通用性強、耐用性好、廣泛普及的籃法與槳法，對于片劑的溶出考察，通常采用槳法，故本方法采用槳法。

2.3.2 溶出介質(zhì)pH值的選擇 由于伊維菌素幾乎不溶于水，吡喹酮在水中不溶[9]，根據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》，對于不溶于水或難溶于水的藥物，可考慮在溶出介質(zhì)中加入十二烷基硫酸鈉或其他適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?。參考《中國獸藥典》2015年版一部“吡喹酮片”的溶出介質(zhì)“含0.2%SDS的鹽酸溶液（9→1000）”與《USP 40－NF 35》“伊維菌素片”的溶出介質(zhì)“含0.5%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液”，選擇SDS作為表面活性劑。根據(jù)“溶出度試驗應(yīng)盡可能在生理條件下進(jìn)行”[5]的原則，盡量使用低濃度的表面活性劑，初步擬定0.2%作為表面活性劑的濃度，考察在pH1.0鹽酸溶液（胃液pH值）、pH7.0磷酸鹽緩沖液（腸液pH值）和中間pH值4.0醋酸鹽緩沖液的溶出介質(zhì)中，伊維菌素吡喹酮片的溶出情況，結(jié)果如下。

伊維菌素在pH1.0鹽酸溶液和pH4.0醋酸鹽緩沖液中均不穩(wěn)定，隨著時間增加降解產(chǎn)物峰面積逐漸增大，且60 min累積溶出量均小于85%；伊維菌素在pH7.0磷酸鹽緩沖液中穩(wěn)定，未檢出降解產(chǎn)物峰，60 min累積溶出量大于85%且達(dá)到平臺期（圖1～圖3）。因此，pH1.0鹽酸溶液和pH4.0醋酸鹽緩沖液對伊維菌素不適用，pH7.0磷酸鹽緩沖液滿足伊維菌素溶出度測定要求。

吡喹酮在不同pH值溶出介質(zhì)中，60 min累積溶出量均大于80%，溶出曲線基本一致（圖4）。因此，不同pH值溶出介質(zhì)對吡喹酮影響較小。

因此，初步選定含0.2%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。

圖1 不同pH值溶出介質(zhì)中伊維菌素5 min色譜圖Fig 1 The chromatograms of ivermectin in different p H of dissolution mediums at 5 minute

2.3.3 表面活性劑濃度的選擇 為了避免過量使用表面活性劑，考察伊維菌素吡喹酮片在含0.05%、0.1%和0.2%SDSpH7.0磷酸鹽緩沖液中的溶出情況，結(jié)果如下。

伊維菌素在含0.05%SDS的溶出介質(zhì)中不能溶出，在含0.1%SDS的溶出介質(zhì)中60 min累積溶出量小于80%且未達(dá)到平臺期，在含0.2%SDS的溶出介質(zhì)中60 min累積溶出量大于85%且達(dá)到平臺期（圖5）。因此，0.2%SDS為伊維菌素溶出度測定的最低濃度。

圖2 不同pH值溶出介質(zhì)中伊維菌素60 min色譜圖Fig 2 The chromatograms of ivermectin in different p H of dissolution mediums at sixty minute

圖3 不同p H值溶出介質(zhì)中伊維菌素溶出曲線Fig 3 The dissolution curves of ivermectin in different p H of dissolution mediums

吡喹酮在不同SDS濃度的溶出介質(zhì)中，60 min累積溶出量均大于80%，溶出曲線基本一致（圖6）。因此，不同SDS濃度對吡喹酮影響較小。

因此，確定0.2%SDS作為表面活性劑的使用濃度，溶出介質(zhì)為含0.2%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液。

圖4 不同pH值溶出介質(zhì)中吡喹酮溶出曲線Fig 4 The dissolution curves of praziquantel in different pH of dissolution mediums

2.3.4 轉(zhuǎn)速的選擇 通常槳法選用的轉(zhuǎn)速為50和75 r/min，為了使溶出方法具有更好的區(qū)分力[10]，考察伊維菌素吡喹酮片在含0.2%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液中轉(zhuǎn)速分別為50和75 r/min的溶出情況，結(jié)果如下。

圖5 三種SDS添加濃度中伊維菌素溶出曲線Fig 5 The dissolution curves of ivermectin in three concentrations of SDS

圖6 三種SDS添加濃度中吡喹酮溶出曲線Fig 6 The dissolution curves of praziquantel in three concentrations of SDS

伊維菌素 50 r/min比 75 r/min在 5、10、20、30 min時的累積溶出量低約5% ～10%，在45、60 min時的累積溶出量大于85%且達(dá)到平臺期（圖7）。因此，對于伊維菌素溶出度測定，50 r/min的區(qū)分力優(yōu)于75 r/min。

圖7 50 r/min與75 r/min時伊維菌素溶出曲線Fig 7 The dissolution curves of ivermectin at 50 r/min and 75 r/min

吡喹酮 50 r/min 比 75 r/min 在 5、10、20、30 min時的累積溶出量低約10% ～20%，在45、60 min的時累積溶出量大于85%且達(dá)到平臺期，曲線平滑（圖8）。因此，對于吡喹酮溶出度測定，50 r/min的區(qū)分力優(yōu)于75 r/min。

因此，確定50 r/min作為轉(zhuǎn)速。

圖8 50 r/min與75 r/min時吡喹酮溶出曲線Fig 8 The dissolution curves of praziquantel at 50 r/min and 75 r/min

2.3.5 溶出介質(zhì)體積的選擇 伊維菌素吡喹酮片中伊維菌素規(guī)格為2 mg/片，檢測方法的定量限以伊維菌素H2B1b峰計約為1.2μg/mL。當(dāng)溶出介質(zhì)體積為900 mL，溶出量小于54%時伊維菌素H2B1b濃度低于定量限濃度，影響溶出曲線繪制的準(zhǔn)確性。當(dāng)溶出介質(zhì)體積為500 mL，溶出量大于30%時伊維菌素H2B1b濃度即大于定量限濃度，更能保證溶出曲線繪制的準(zhǔn)確性。因此，擬初步選擇500 mL作為溶出介質(zhì)體積。

考察伊維菌素和吡喹酮在含0.2%SDS的pH7.0磷酸鹽緩沖液中的溶解情況，結(jié)果顯示，50 mg的吡喹酮和2 mg的伊維菌素分別在約100 mL和150 mL的溶出介質(zhì)中達(dá)到飽和，500 mL符合漏槽條件即“溶出介質(zhì)體積一般至少為藥物達(dá)到飽和溶液所需體積的三倍”的要求。

因此，確定500 mL為溶出介質(zhì)體積。

2.3.6 取樣時間與限度的選擇 三批樣品的伊維菌素和吡喹酮30 min累積溶出量均大于85%且達(dá)到平臺期（圖9～圖10），根據(jù)“溶出度取樣時間點常選擇溶出曲線拐點處后推10至20 min，并將該點溶出量減去15%作為限度”的原則[11]，選擇45 min作為取樣時間點，并將45 min的累積溶出量減去15%作為溶出限度。因此，取樣時間確定為45 min，吡喹酮和伊維菌素的限度規(guī)定為不少于標(biāo)示量的70%。

圖9 三批樣品伊維菌素溶出曲線Fig 9 The dissolution curves of ivermectin for three batches of ivermectin and praziquantel chewable tablet

圖10 三批樣品吡喹酮溶出曲線Fig 10 The dissolution curves of praziquantel for three batches of ivermectin and praziquantel chewable tablet

2.3.7 溶出方法的確定 綜上所述，最終擬定溶出條件為:以含0.2%十二烷基硫酸鈉的pH7.0磷酸鹽緩沖液（稱取2 g十二烷基硫酸鈉，1.2 g無水磷酸二氫鈉，加水1000 mL使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）500 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，在45 min取樣測定，吡喹酮和伊維菌素的限度為不少于標(biāo)示量的70%。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的確定 由于篇幅原因，同時檢測伊維菌素和吡喹酮溶出量的高效液相色譜法的建立過程及方法學(xué)驗證不在此篇論述。

3.2 SDS濃度的確定 在進(jìn)行SDS濃度的選擇時，通過伊維菌素溶出曲線的比較，確定了0.2%SDS作為表面活性劑的最低濃度，考慮到在該濃度水平下伊維菌素和吡喹酮的溶出曲線滿足30 min累積溶出量大于85%，以及“溶出度試驗應(yīng)盡可能在生理條件下進(jìn)行”的原則，盡量使用低濃度表面活性劑，且更容易具有區(qū)分力，因此，未進(jìn)一步增加SDS的濃度進(jìn)行考察，確定0.2%作為SDS的濃度。

3.3 轉(zhuǎn)速的確定 在進(jìn)行轉(zhuǎn)速的選擇時，吡喹酮75 r/min的溶出曲線在45和60 min時發(fā)生下降，分析原因，可能是由于轉(zhuǎn)速較高時，吡喹酮溶出過快，在5 min時大于70%，10 min時大于85%，20和30 min時達(dá)到90%，溶出完全，而溶出曲線繪制時每個時間節(jié)點取液5 mL與補液5 mL存在一定的操作誤差、精密量取1 mL稀釋至10 mL的操作誤差、儀器測定誤差以及完全溶出后溶出杯中殘余的不溶性輔料干擾取液等造成的，明確的原因有待進(jìn)一步試驗驗證。對于伊維菌素和吡喹酮，50 r/min的區(qū)分力均優(yōu)于75 r/min，因此，確定50 r/min作為溶出方法的轉(zhuǎn)速。

3.4 結(jié)論 本文通過采用高效液相色譜法測定在不同pH值溶出介質(zhì)、不同濃度表面活性劑和不同轉(zhuǎn)速的條件下伊維菌素吡喹酮咀嚼片兩種主藥的溶出曲線，確定了伊維菌素吡喹酮咀嚼片的溶出條件，建立了同時測定伊維菌素吡喹酮咀嚼片兩種主藥溶出度的測定方法。該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于伊維菌素吡喹酮咀嚼片溶出度的測定。