李欣陽

（陜西師范大學(xué)，陜西西安 710100）

嵌 合 抗 原 受 體（Chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞已經(jīng)在血液腫瘤的臨床治療上獲得了廣泛認(rèn)可，2017年7月，Tisagenlecleucel被美國FDA認(rèn)證可用于兒童和成人（3～25歲）的R/R B-ALL患者的治療，但CAR-T引發(fā)D的同種異體T細(xì)胞引起的移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD），使得CAR-T在制備上只能用患者自體T細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞（Nature killer cell，NK）能以自發(fā)的方式殺死靶細(xì)胞，無主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）限制性，因此 CARNK在腫瘤免疫治療領(lǐng)域受到了更廣泛的關(guān)注。

1 NK細(xì)胞

NK細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來，在限制腫瘤轉(zhuǎn)移方面尤為重要。常用的人NK細(xì)胞表型標(biāo)志是 CD56+、CD16+、CD19-、CD3-，既不表達(dá) T細(xì)胞的表型，又不表達(dá)B細(xì)胞的表型。根據(jù)NK細(xì)胞表達(dá)CD56分子表面密度，可將其分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，CD56dimNK細(xì)胞亞群以殺傷功能為主，可介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 作 用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC）。CD56brightNK細(xì)胞亞群以分泌細(xì)胞因子為主，且CD56dimNK細(xì)胞亞群比CD56brightNK細(xì)胞亞群更具天然細(xì)胞毒性。

NK細(xì)胞表面具有兩類受體。第一類受體可以激活NK細(xì)胞的殺傷作用，稱為激活性受體，包括NKG2D、NCR等；第二類受體可以抑制NK細(xì)胞的殺傷作用，被稱為抑制性受體，包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白 樣 受 體（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）和NKG2家族（NKG2A、B、C和E/CD94）。主流觀點認(rèn)為，NK細(xì)胞是通過活化和抑制受體信號之間的平衡來區(qū)分正常的健康細(xì)胞和敏感靶細(xì)胞，最終決定NK效應(yīng)功能。

活化的NK細(xì)胞主要通過4種途徑發(fā)揮細(xì)胞毒作用。第一種途徑是穿孔素/顆粒酶途徑，通過細(xì)胞膜滲透性的增加引起靶細(xì)胞裂解。第二種途徑是Fas/FasL途徑。Fas向細(xì)胞傳遞“死亡信號”，與FasL結(jié)合，使靶細(xì)胞凋亡。第三種途徑是細(xì)胞因子途徑，激活目標(biāo)細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，降解基因組DNA。第四種途徑是表達(dá)IgGFc受體，通過ADCC效應(yīng)殺傷靶細(xì)胞。因此，NK細(xì)胞是臨床腫瘤免疫治療中極具潛力的淋巴細(xì)胞。

2 CAR-NK細(xì)胞

CAR-NK具有CAR-T的基本框架，包括細(xì)胞外抗原識別部分、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是抗原識別位點，跨膜結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)組分的連接，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域衍生于 T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）/CD3。CAR-NK通常使用CD3ζ作為第一信號基序，加入共刺激分子基序，如CD28/CD137或CD28-CD137，以形成細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)域。

2.1 抗原識別區(qū)

抗原識別區(qū)通常由衍生自單克隆抗體（Monoclonal antibody，mAb）的重鏈和輕鏈的可變區(qū)片段（Single chain variable fragment，scFv）組成，通過柔性接頭融合在一起，無需抗原遞呈細(xì)胞的參與，即可將免疫細(xì)胞定向到腫瘤相關(guān)抗原（Tumor- associated antigen，TAA）。迄今為止研究的大多數(shù)scFv是鼠源的，會在人體內(nèi)引起細(xì)胞介導(dǎo)的排斥或者致敏反應(yīng)，或者引起人抗小鼠抗體（Human anti-mouse antibody，HAMA）或抗獨特型免疫應(yīng)答，所以，許多研究人員正在探索人類化scFv以規(guī)避HAMA的發(fā)生，如抗人類表皮生長因子受體 2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的FRP5抗體等[1]。

為了提高CAR-NK特異性識別腫瘤的能力，可將NK細(xì)胞表面活化型受體的配體放在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的設(shè)計中，如NKG2D。NKG2D是在大多數(shù)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)的關(guān)鍵活化受體，與死亡相關(guān) 蛋白 10（death-associated protein 10，DAP10）或DAP12轉(zhuǎn)移蛋白結(jié)合，提供不同的激活信號，這兩種信號均可激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

2.2 細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)

跨膜區(qū)一般被認(rèn)為對CAR-NK細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)和功能都沒有太大的影響。目前CAR-NK已經(jīng)運用了多種跨膜區(qū)，如CD3ζ/CD8的跨膜序列等。CARNK活化信號的強(qiáng)弱是由胞內(nèi)信號區(qū)的結(jié)構(gòu)決定的，其所含的ITAM會在胞外受體與其配體相互作用被酪氨酸激酶磷酸化，從而招募Syk或者ZAP70，進(jìn)而對下游蛋白磷酸化傳遞信號，CD3ζ是CAR結(jié)構(gòu)的經(jīng)典細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)段，CAR結(jié)構(gòu)中含有單一ITAM的DAP12和含有3個ITAM的CD3ζ具有相同的活化下游信號的能力。

3 CAR-NK細(xì)胞用于抗腫瘤治療

近年來，CAR-T在多種血液腫瘤臨床治療取得了成果，但也存在如細(xì)胞因子風(fēng)暴、GVHD等負(fù)面效應(yīng)。NK細(xì)胞同種異體反應(yīng)具有提高異基因造血干細(xì)胞移植治療的潛力，因此NK細(xì)胞被用于腫瘤免疫治療。CAR-NK的目標(biāo)是建立新的激活途徑以增強(qiáng)細(xì)胞的抗腫瘤作用并改善腫瘤細(xì)胞靶向，它能夠?qū)Χ喾N惡性腫瘤表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[2]。

大量臨床前研究已經(jīng)測試了CAR-NK細(xì)胞對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的各種靶抗原的療效，如CD19、CD20、CD138等。Shimasaki N等[3]在白血病小鼠模型中測試人NK細(xì)胞中含有CD3ζ和4-1BB信號傳導(dǎo)分子受體的表達(dá)，結(jié)果表明表達(dá)抗CD19-BB-ζ的NK細(xì)胞在體外對CD19陽性靶細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性，并分泌高水平的干擾素（IFN）-γ，在B細(xì)胞白血病的異種移植模型中發(fā)揮了相當(dāng)大的細(xì)胞毒性。Chu Y等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，多次注射抗CD20 CAR修飾的exPBNK也延長了B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B-cellnon-Hodgkinlymphoma，B-NHL）腫瘤 -異種移植物的存活，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。

除治療血液腫瘤外，CAR-NK在實體瘤方面也 有 不 錯 效 果 ，包 括 HER-2 / Erb-2 等 靶 抗 原。Sch?nfeld K 等[5]將已建立的人 NK-92 細(xì)胞重定向至腫瘤相關(guān)的 ErbB2（即 humanepidermalgrowth factor receptor-2，HER2）抗原，構(gòu)建攜帶CD28和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的ErbB2特異性抗體FRP5（CAR5.28.z），產(chǎn)生表達(dá)人源化CAR的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系，結(jié)果顯示NK-92 / 5.28.z細(xì)胞在體外能有效裂解表達(dá)ErbB2的腫瘤細(xì)胞，顯示出連續(xù)的靶細(xì)胞殺傷作用。Liu等[6]人通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）在細(xì)胞表面上表達(dá)高水平融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92-抗erbB2 scFv-CD28-ζ細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞特異性地增強(qiáng)了表達(dá)erbB2的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453和SKBr3的細(xì)胞死亡。CAR-NK在實體瘤方面的發(fā)展以使其成為腫瘤免疫的新起之秀。

4 CAR-NK細(xì)胞的優(yōu)勢與發(fā)展

最近加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校[7]設(shè)計了9種靶向間皮素的CAR構(gòu)建體進(jìn)行體外殺傷實驗，并在小鼠模型中比較CAR-NK和CAR-T細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，CAR-NK細(xì)胞具有更小的毒性，比CAR-T細(xì)胞更安全。其次，同種異體NK細(xì)胞不會引發(fā)GVHD，并降低長期存在產(chǎn)生的毒副作用；此外，CAR-NK細(xì)胞保留了通過自身天然受體識別和靶向腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在能力。因此，與CAR-T細(xì)胞相比，即使理論上腫瘤細(xì)胞下調(diào)CAR靶抗原，它們也不太可能逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視，同種異體NK細(xì)胞為免疫療法提供了應(yīng)用潛力。

如何改造NK細(xì)胞才能表現(xiàn)出最佳效果，仍是未來CAR-NK研究領(lǐng)域的主要問題。CAR-NK作為一種新型的治療腫瘤的免疫方法，和其他抗腫瘤技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合運用為一些腫瘤患者帶來了希望，即使它存在不足但潛力巨大，希望之后的研究能夠使CAR-NK不斷的完善發(fā)展。