孫月彤，李洪艷，鄒偉

遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連116081

干細胞是一類具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下可以分化成多種功能細胞。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是神經系統(tǒng)中恒定存在的可進行自我更新及多向分化的原始細胞，可以分化為神經元和多種膠質細胞。近年來，越來越多的研究關注于NSCs 且取得了許多新的進展，而對NSCs 移植治療神經系統(tǒng)疾病和損傷的研究也愈發(fā)深入。然而，NSCs 的增殖與分化能力會逐漸衰退，這成為制約NSCs 體外擴增的問題之一。從分裂新生到衰老死亡是細胞的必經歷程，NSCs 也無法避免，這也成為NSCs 臨床應用的瓶頸。本文簡要綜述了NSCs 自我更新與衰老機制的基礎，旨在為NSCs 臨床應用及干細胞組織工程研究提供理論依據。

1 NSCs 的發(fā)現及其在腦組織內的分布

Reynolds 和Richards 于1992 年首 次 從成年 鼠的紋狀體和海馬中分離出一種可以自我更新并具有多向分化潛能的細胞群落，命名為NSCs[1]。目前認為NSCs 主要存在于哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)，尤其胚胎時期，NSCs 存在于大部分腦區(qū)，如皮質、嗅球、紋狀體、海馬、脊髓等[2-3]。也有研究表明，人類胚胎的室管膜下區(qū)、海馬、嗅球均有NSCs 存在，近年發(fā)現成人海馬、嗅球、室管膜下區(qū)等腦區(qū)域內都存內源性NSCs 或前體細胞[4]。

2 NSCs 的自我更新

干細胞的特征是具有極強的自我更新能力并可分化為多種類細胞。干細胞能夠通過2 種分裂方式來維持自我更新，即對稱分裂和不對稱分裂[5]，NSCs 作為干細胞的一個重要分類也具有這2 種分裂方式。1 個NSCs 分裂為2 個NSCs 或2 個神經祖細胞（neural progenitor cells，NPCs）為對稱分 裂，1 個NSCs分裂為1 個NSCs 和1 個NPCs 或1個NSCs 和1 個凋亡細胞為不對稱分裂[6-7]。值得注意的是，在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中，NSCs 先通過對稱分裂進行擴增，再經歷不對稱的神經源性分裂，即其中一個子細胞仍然是一個增殖性的NPCs，而另一個子細胞經過一個或多個輪回擴增分裂后最終分化，一旦NSCs 完成了不對稱的神經源性分裂，它們通常會經歷細胞凋亡或進入衰老狀態(tài)并減少增殖[8]。

大量研究發(fā)現，Wnt/β-catenin 和Notch 信 號通路在控制干細胞增殖和分化中起關鍵作用。Chen 等[9]曾報道，缺氧缺血后氧化亞硝酸鹽生成并增加了β-catenin 的核內積累，同時激活NSCs的Wnt/β-catenin 信號通路，發(fā)揮其促進神經發(fā)生的作用。而腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的過表達則會增強Wnt/β-catenin 信號通路促進體外hESC-NSC 的生長[10]。此外還發(fā)現[11]，NSCs 的Wnt/β-catenin 信號通路在3%的低氧培養(yǎng)條件下被進一步激活并縮短了細胞周期，從而促進了NSCs 的增殖。這說明神經系統(tǒng)處于不利條件時，能夠提升NSCs 的干 性，增 強Wnt/β-catenin 信號通路的表達，促進NSCs 的增殖及分化，并抵抗神經損傷進行自我修復。在基因水平上，microRNA 也參與了Wnt/β-catenin 通路的調節(jié)。研究表明，miR-124可以抑制β連環(huán)蛋白抑制基因1（dishevelled binding antagonist of beta catenin 1，DACT1）的表達并刺激Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進NSCs的增殖及分化[12]。但與miR-124 的正向促進作用不同，miR-148b 能夠抑制Wnt/β-catenin 通路的表達。腦損傷后的miR-148b 過表達會抑制Wnt/βcatenin 通路的傳導和周期蛋白D1 的表達，減弱神經干細胞的增殖和分化[13]，而Notch 信號通路的激活或抑制也被證明決定了神經干細胞的增殖和分化[14]。研究表明，NSCs 中miR-124 的過度表達可抑制Notch 配體DLL4 的表達而使Notch 信號通路失活，并以此促進NSCs 增殖及神經分化[15]。但出現腦損傷后，某些治療藥物對NSCs 的促增殖作用是通過上調Notch 信號通路，促進CDK4、周期蛋白D1、NICD、Hes1 的表達，而這種激活作用受自我更新相關基因Notch1 和HES1 的調節(jié)[16-17]。

3 NSCs 的自噬和凋亡

自噬是真核生物中普遍存在的一種細胞自我保護機制，是指吞噬自身內容蛋白或細胞器后包入囊泡并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而降解所包裹的內容物的過程[18]。正常機體內的大多數干細胞處于靜息狀態(tài)且壽命很長。靜息狀態(tài)下，干細胞清除廢物和衰老細胞器的能力有限，且為了完成分化需要對自身進行重塑，因此比其他類型的細胞更需要自噬的調節(jié)[19]。雖然自噬在維持NSCs 穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，但過度自噬會導致細胞的自我消除。K+通道是一類廣泛分布于細胞膜上且亞型眾多的離子通道，不同類型的K+通道可以通過激活Akt/mTOR 或AMPK/mTOR通路誘導內皮細胞、心肌細胞、肝細胞等多種細胞的自噬[20]。Chung 等用GFP-LC3 表達質粒對NSCs 進行轉染，發(fā)現自噬蛋白LC3-II、Beclin-1 表達水平上調能夠促進NSCs 的過度自噬[21]。雖然過度自噬會導致NSCs 的自我消除，但令人驚奇的是，在進行神經分化時，自噬能夠促進NSCs 向神經元分化。Pablo 等[22]發(fā)現，在NSCs 向神經元分化的過程中，神經源性標記物Ngn1（神經源蛋白1）、NeuroD（神經源性分化蛋白）、β-III-tubulin（微管蛋白）明顯上調，同時自噬相關基因Atg7、Becn1、Ambra1 和LC3 同步上調，該結果證明了自噬參與NSCs 向神經元分化的過程。自噬對NSCs而言是一把雙刃劍，倘若能夠人為地對自噬進行調節(jié)，就可以有效調控NSCs 的分化和衰老進程。

細胞凋亡也對NSCs 的功能有著重要影響。許多研究表明，細胞凋亡蛋白酶（caspase）在細胞凋亡進程中起重要作用。Yuan 等發(fā)現，棕櫚酸通過上調Bax 和caspase-3 和下調Bcl-2 的表達來促進NSCs 的凋亡，其機制與JNK 信號轉導有關[23]。Zou 等[24]觀察到異丙酚能夠通過內源性和外源性2 種途徑誘導小鼠胚胎NSCs 的凋亡，且2 種凋亡途徑間存在相互作用，即由外源性途徑激活的caspase-8 裂解產生tBid（細胞凋亡調控蛋白），tBid 由胞漿轉移到線粒體膜上刺激細胞色素C 的釋放，并與胞漿蛋白APAF-1 激活caspase-9，加強外源性途徑的凋亡效應。由此可見，多種caspase的激活及凋亡相關蛋白的釋放可加速細胞凋亡。Wan 等[25]發(fā) 現，NSCs 經p38-shRNA轉染并經TNFα處理后會增加Bax 和caspase-3 等促凋亡分子的分泌，降低抗凋亡分子Bcl-2 的表達，從而加速NSCs 的凋亡，但是通過靶向抑制p38-MAPK 通路則可逆轉TNF-α 誘導的細胞凋亡。這表明TNFα與MAPK 在NSCs 中的相互作用。以上結果也說明，與正常細胞相比，NSC 中的caspase 可與p38- MAPK 或JNK 信號轉導通路共同調控細胞凋亡。

4 NSCs 的衰老

雖然NSCs 具有多項分化潛能和極強的自我更新能力，但同機體的衰老一樣，NSCs 也會逐漸衰老并喪失干性，而其細胞活力和增殖能力取決于端粒酶活性及端粒的損耗程度。Ferrón 等[26]從缺乏端粒酶RNA 成分的小鼠體內分離成體及胚胎NSCs 進行體外增殖，發(fā)現在缺少端粒酶活性的情況下，端粒受到侵蝕且p53 蛋白表達水平增加，最終導致成體NSCs 喪失增殖能力；而胚胎NSCs在端?？s短和核p53 蛋白表達水平增加的情況下仍能進行廣泛增殖。除了端粒及端粒酶的影響，NSCs 活性還受DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑等多種表觀遺傳變異因素的調控。在衰老過程中，染色質組織會發(fā)生顯著變化，從而改變轉錄水平。有研究表明，間充質干細胞（mesenchyma stem cell，MSCs）中甲基化CpG 結合蛋白2（MECP2）的部分沉默能夠誘導MSCs 的衰老，同時導致受損DNA 的增加[27]。最近，Melone 等[28]還發(fā)現，MECP2 基因缺失會導致小鼠體內衰老的NSCs 數量增加、增殖能力降低且未修復的DNA病灶積累，最終加速神經系統(tǒng)的衰老。上述研究表明，NSCs 的衰老受基因、蛋白修飾、端粒長度及活性等諸多因素的影響。因此，解決NSCs 的衰老問題不僅要從蛋白水平進行調控，還需要尋找與衰老相關的基因靶點，實現蛋白和基因水平的雙項調控。

與活化的NSCs 一樣，未經活化的靜息NSCs也同樣面臨衰老的問題。機體內貯存干細胞的特化結構通常稱為干細胞池（stem cell pool），這些干細胞池內不僅包含活化的干細胞，還包含靜息干細胞。它們的種類各異，作用相似。然而到目前為止，維持增殖和衰老的機制尚不清楚。例如，如何維持蛋白質穩(wěn)態(tài)和處理蛋白質聚集在很大程度上是未知的。Brunet 等[29]的最新研究指出，靜息與活化狀態(tài)的NSCs 在蛋白質穩(wěn)態(tài)網絡上存在不同，活化的NSCs 擁有活性蛋白酶體，而靜息的NSCs 含有大的溶酶體，溶酶體內儲存著不斷積累的蛋白質聚集體，同時靜息NSCs 中溶酶體活性的波動會影響蛋白質聚集體積累和靜息NSCs激活的能力。當NSCs 處于衰老狀態(tài)時，靜息的NSCs 在其溶酶體活性上顯示出缺陷，且蛋白質聚集體的積累增加，導致活化能力降低。這也提示可以通過激活衰老NSCs 中的溶酶體或者讓NSCs處于饑餓狀態(tài)來限制其蛋白合成，從而清除干細胞池內的蛋白聚合物，恢復衰老NSCs 的活化能力，使靜息NSCs 重新呈現年輕態(tài)。

5 結語

神經退行性疾病主要由大腦或脊髓中的神經元和膠質細胞受損引起。與傳統(tǒng)的康復治療和長期藥物維持治療相比，近年來，日趨成熟的干細胞移植治療法為神經退行性疾病患者帶來新的希望。由于NSCs 能夠分化為神經元及各種膠質細胞，使其成為干細胞治療的重要細胞來源之一。一項最新研究指出，星形膠質細胞的功能障礙是神經發(fā)育和神經退行性疾病發(fā)病機制的驅動因素，而星形膠質細胞是由NSCs 后期分化產生[30]。因此，NSCs 在治療神經退行性疾病方面存在巨大潛力。相信通過對NSCs 的衰老及自噬的不斷研究，定會解決體外培養(yǎng)NSCs 的早衰及功能減退等問題，最終實現從根本上治療神經退行性疾病。