鄒夢蝶，魯妍兵，李婉明

(中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院衛(wèi)生部細胞生物學(xué)重點實驗室醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)教育部重點實驗室細胞生物學(xué)教研室，中國遼寧沈陽110122)

核酸適配體(aptamer)通常是指在體外利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的一段短的寡核苷酸片段(ssDNA或RNA)，它能與靶標高親和力、高特異性的結(jié)合[1～2]。核酸適配體通過分子內(nèi)堿基配對形成如假結(jié)(pseudoknot)、發(fā)夾(hairpin)、凸環(huán)(coronal ring)、G-四鏈體(G-quartet)等穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，從而使其具有特定的分子構(gòu)象[3]。作為一種“化學(xué)抗體”，核酸適配體與靶標的結(jié)合類似于抗原-抗體的結(jié)合方式，而且與蛋白質(zhì)抗體相比，核酸適配體有著更大的靶標范圍，包括多肽[4]、金屬離子[5]等小分子物質(zhì)，以及生長因子[6]、酶[7]等生物大分子，甚至完整的細菌[8]和活細胞[9]等。

目前很多核酸適配體的獲得都是針對特定的靶標篩選而來的，其中以全細胞為靶標篩選(cell-SELEX)的靶標物質(zhì)通常是整個活細胞[10]?，F(xiàn)階段cell-SELEX篩選主要存在以下兩種思路[11]。其一，靶細胞直接為過表達某種靶蛋白的細胞系，消減細胞為不表達該靶蛋白的細胞系，比如Kim等[12]利用過表達上皮黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的肝癌細胞HepG2進行篩選，消減細胞為HepG2細胞，篩選出針對EpCAM的核酸適配體。其二，直接對某一腫瘤細胞系進行篩選，消減細胞為正常細胞系或相關(guān)腫瘤細胞系，然后再用得到的核酸適配體來“釣取”及鑒定靶標[13]。這種策略在篩選開始前不用對細胞表面的分子及結(jié)構(gòu)等信息進行準確的了解，而且獲得的核酸適配體可直接用于活細胞的識別，這使得核酸適配體在細胞分子的識別、疾病相關(guān)生物標志物的發(fā)現(xiàn)，以及疾病的早期診斷和靶向治療等方面顯示出強大的實際價值和應(yīng)用前景[14～15]。本文針對目前在cell-SELEX基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新策略進行總結(jié)。

1 以全細胞為靶標的篩選(cell-SELEX)

1998年，Morris等[16]首次成功針對復(fù)雜靶標進行了細胞核酸適配體的篩選，為全活細胞SELEX篩選的發(fā)展開辟了道路。這種以全細胞為靶標的篩選將整個活細胞作為靶標物質(zhì)，區(qū)別于從細胞中分離純化出蛋白質(zhì)組分，利用完整的細胞表面分子與單鏈核酸之間的相互作用來進行分子識別[17]。

通常情況下，無論是采用已知靶標或者是未知靶標的篩選方式，在篩選的過程中都會引入一個消減的策略，使得篩選到的核酸適配體具有更強的結(jié)合特異性，同時為了有效減弱甚至消除既與靶分子結(jié)合又與靶分子類似物結(jié)合的核酸序列，通常在每輪正向篩選后增加一個反向篩選，從而可以更可靠地篩選出與靶分子具有高度結(jié)合特異性的核酸適配體[18]。也就是說，cell-SELEX用來篩選特異性識別靶細胞的核酸適配體的核心技術(shù)是依靠任意兩種完整活細胞表面分子水平上的差異來完成的。理論上，只要兩種細胞之間存在分子水平上的差異，就能夠通過消減cell-SELEX技術(shù)篩選出特異性識別這種分子水平差異的核酸適配體[19]。這種篩選方法具有很多特有的優(yōu)點[20]:1)核酸適配體能夠識別具有天然構(gòu)象的分子，具有更大的實際應(yīng)用價值;2)一次篩選可獲得多個識別不同靶標的核酸適配體;3)核酸適配體不僅可用于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，還可為相關(guān)疾病的早期診斷和靶向治療提供有效的分子工具。

目前，利用這種消減策略已經(jīng)篩選出多個靶向不同類型腫瘤細胞[21～25]的核酸適配體，當(dāng)然也有一些是靶向感染細胞[26]或正常細胞[27]的核酸適配體，這對核酸適配體在初期臨床診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用十分有利。本課題組利用消減cell-SELEX技術(shù)，以轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞系LoVo為靶細胞，非轉(zhuǎn)移性細胞系HCT-8為消減細胞，成功獲得了一組靶向轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞的核酸適配體[22]，這些核酸適配體有望在早期轉(zhuǎn)移性大腸癌的診斷和治療中發(fā)揮作用。針對感染細胞的核酸適配體可用于診斷一些具有潛伏期的傳染性疾病，例如:Graham等[26]利用感染/未感染人乳頭瘤病毒的HeLa細胞作為配對細胞進行SELEX篩選，成功篩選出不能與感染此類病毒的宮頸癌細胞結(jié)合的核酸適配體，可用于宮頸癌的初期診斷，同時也可用于鑒定癌細胞有無乳頭瘤病毒感染。Kim等[27]利用3T3-L1的成熟脂肪細胞和前脂肪細胞作為配對細胞進行篩選，獲得了針對成熟白色脂肪細胞的核酸適配體，將此核酸適配體與藥物分子相連，則有望進行抗肥胖治療相關(guān)的研究。這些通過消減cell-SELEX技術(shù)篩選獲得的核酸適配體，不僅可直接用于整個細胞的識別，還可以對與其結(jié)合的靶標進行純化、鑒定，這樣新的分子標志物就有可能被發(fā)現(xiàn)。

2 細胞特異性核酸適配體在腫瘤研究中的應(yīng)用

由于核酸適配體具有獨特的高親和性、高特異性、高穩(wěn)定性和易于修飾等優(yōu)勢，因此其在進行疾病的早期診斷和靶向治療中具有重要的臨床意義，尤其是腫瘤研究領(lǐng)域，利用cell-SELEX篩選獲得的核酸適配體具有其獨特的優(yōu)勢。Shangguan等[28]利用消減cell-SELEX技術(shù)獲得一組白血病細胞特異性的核酸適配體，初步鑒定它們的靶分子有些是膜表面的蛋白質(zhì)，也有些是其他細胞表面分子，如脂類或糖類物質(zhì)等。根據(jù)靶標的不同特性，利用cell-SELEX獲得的核酸適配體可以進行不同的功能性應(yīng)用。1)利用核酸適配體結(jié)合細胞表面分子的能力，可以將其與熒光基團、放射性同位素或納米材料等結(jié)合，從而用于特異性細胞的富集和成像[29]。比如:將熒光基團Cy5標記針對B細胞淋巴瘤的核酸適配體TD05后，可將其用于針對裸鼠腫瘤的高特異性體內(nèi)靶向成像[30];2)利用核酸適配體結(jié)合細胞表面受體的能力，可以將其用作載體，實現(xiàn)將多種物質(zhì)靶向遞送至特定的細胞/組織[31]。我們課題組前期利用大腸癌特異性核酸適配體L33作為載體，構(gòu)建了抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)的靶向遞送系統(tǒng)(L33-DOX)[32]。L33-DOX選擇性地被攝入靶細胞中并實現(xiàn)靶向殺傷作用，同時還可降低對非靶細胞的毒性作用;3)利用核酸適配體結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子的能力，可以將其作為阻斷特定信號傳導(dǎo)途徑的特異性治療劑[33]。由于利用cell-SELEX篩選獲得的核酸適配體是基于它們與靶細胞的結(jié)合而被篩選出來的，其中一組篩選獲得的核酸適配體并不都結(jié)合于同一個靶分子但結(jié)合于同一靶細胞，因此這些核酸適配體可以聯(lián)合應(yīng)用進行多靶點的診斷和治療應(yīng)用[34]。這是cell-SELEX技術(shù)與以單一物質(zhì)作為靶標的經(jīng)典SELEX方法相比所具有的獨特優(yōu)勢。

3 Cell-SELEX篩選的新策略

傳統(tǒng)的cell-SELEX篩選仍然存在一些不足，比如篩選效率低、周期長、獲得的核酸適配體性能不佳等問題。此外，細胞表面分子相對單一靶分子來說較復(fù)雜，以全細胞為靶標進行篩選具有更大的難度。因此，不少研究者針對這些問題發(fā)展和建立了新的更為高效的細胞核酸適配體篩選方法和技術(shù)。

3.1 熒光激活細胞分選SELEX(FACS-SELEX)

Mayer等[35]將流式細胞儀結(jié)合到細胞核酸適配體的篩選中，利用流式細胞儀的分選功能，建立了一種基于流式細胞儀的熒光激活細胞分選法(fluorescence activated cell sorting-SELEX，F(xiàn)ACSSELEX)，以用于細胞核酸適配體的篩選。該方法將熒光標記的寡核苷酸文庫與靶細胞一起孵育，這樣流式細胞儀可以高靈敏、高通量、高效地同時區(qū)分和分離與序列結(jié)合的細胞，然后將結(jié)合的序列進行洗脫、純化和擴增。細胞膜的完整性是cell-SELEX篩選成功的先決條件，因此在篩選的過程中必須消除由死細胞造成的非特異性吸附所帶來的核酸序列，而流式細胞儀可以通過在膜完整細胞的正向和側(cè)向散點圖中設(shè)置感興趣區(qū)域來排除死細胞的影響，從而可以有效地消除假陽性，提高篩選效率。Mayer等的實驗僅用10輪篩選便成功得到了特異性核酸適配體。2014年，Kim等[12]采用此方法，僅經(jīng)過7輪的篩選就獲得了針對上皮細胞黏附分子(EpCAM)的核酸適配體，EpCAM是一個在大多數(shù)腺癌和腫瘤干細胞中表達的跨膜蛋白，利用該抗EpCAM的核酸適配體可以開展干細胞標記物或干細胞或腫瘤細胞相關(guān)的其他研究。

3.2 單壁碳納米管輔助細胞SELEX(SWCNTs輔助cell-SELEX)

單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)因其獨特的電化學(xué)和機械性能以及廣闊的應(yīng)用前景而不斷地被探索[36]。單壁碳納米管輔助細胞SELEX技術(shù)是一種以單碳納米管為輔助的細胞篩選方法，與傳統(tǒng)的cell-SELEX方法相比，單壁碳納米管輔助細胞SELEX技術(shù)具有更高的篩選效率，能夠有效地縮短篩選的周期[37]。在細胞篩選過程中將特異性和非特異性結(jié)合的單鏈序列分開是提高篩選效率的重要步驟之一，傳統(tǒng)的cell-SELEX方法主要使用簡單洗脫的方法來實現(xiàn)，但往往會導(dǎo)致分離的不完全，甚至造成篩選效率的低下;而SWCNTs輔助cell-SELEX方法利用核酸能夠通過π-π堆積力而成螺旋形地包裹在單壁碳納米管上的原理[38]，使與靶標特異性結(jié)合的核酸序列仍然結(jié)合在細胞表面，而不能與靶標特異性結(jié)合或者結(jié)合力比較弱的核酸序列則被吸附在納米管上，從而實現(xiàn)非特異性和特異性序列的快速、有效、準確的分離。2014年，Tan等[39]首次報道了這種方法，其以鼻咽癌細胞作為模型進行篩選，只進行了6輪的篩選就成功地獲得特異性識別靶細胞CNE2的核酸適配體，這與常規(guī)cell-SELEX的15輪篩選周期相比，大大縮短了細胞篩選周期，為cell-SELEX的篩選提供了一個新的視角，也引起了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的高度關(guān)注。相信在未來的發(fā)展中，SWCNTs將在核酸適配體的篩選及應(yīng)用中發(fā)揮更大的使用潛能。

3.3 基于芯片的細胞SELEX(on-chip cell-SELEX)

微流控芯片技術(shù)具有功能可集成化、操作簡便、高通量等一系列的優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也展示出廣泛的應(yīng)用價值。Hung等[40]在傳統(tǒng)cell-SELEX方法的基礎(chǔ)上，整合微流控芯片技術(shù)，建立了一種速度快、通量高、效率高的自動化篩選方法——基于芯片的細胞篩選技術(shù)(on-chip cell-SELEX)。該方法的核心是先將上皮細胞抗體修飾在磁珠表面，并將其先與靶細胞孵育，再與核酸文庫進行孵育，抗體與靶細胞結(jié)合使磁珠包被在細胞表面，形成的磁珠靶細胞適配體結(jié)合物可以在通過外磁場作用分離出來的同時進行PCR擴增。該方法以卵巢癌細胞TOV21G為靶標，只進行了5輪的篩選就成功獲得了13種卵巢癌細胞高特異性結(jié)合的核酸適配體。此外，每輪篩選時間大大縮短，由9 h降到3 h，篩選效率大幅度提高。2015年，Hung等[41]利用此自動化系統(tǒng)進一步成功篩選出多個特異性結(jié)合直腸癌細胞(CRSC/CRC)的核酸適配體，其中3個核酸適配體與靶細胞具有很強的親和力，解離常數(shù)分別達到27.4 nmol/L、28.5 nmol/L和12.3 nmol/L?；谛酒募毎Y選技術(shù)不僅能夠克服人為操作導(dǎo)致的不利因素，提高篩選效率，而且在微流控通道中可以運行單個細胞，對后續(xù)的收集及PCR擴增十分有利[42]。然而，目前該方法的應(yīng)用仍舊很少，發(fā)展仍舊很慢，主要原因是芯片的設(shè)計和制作不僅成本較高，而且還有較高的專業(yè)性要求?？偟膩碇v，如果微流控芯片可以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其必定能在未來成為篩選核酸適配體的主流技術(shù)。

3.4 體內(nèi)細胞SELEX(in vivo cell-SELEX)

隨著cell-SELEX技術(shù)的改良與發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)利用體外細胞系作為靶細胞進行篩選得到的核酸適配體，雖然在一定程度上能夠模擬體內(nèi)活細胞，但由于核酸適配體的構(gòu)象會受到其所處環(huán)境的影響，因此體外篩選所得的核酸適配體在體內(nèi)應(yīng)用時往往受到限制。2010年，Mi等[43]報道了一種新的體內(nèi)篩選方法(in vivo cell-SELEX)，即通過靜脈注射的方式將2′-氟嘧啶修飾的隨機RNA文庫注入肝內(nèi)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移小鼠模型體內(nèi)，一段時間后處死小鼠取出瘤體，分離并反轉(zhuǎn)錄與瘤體結(jié)合的RNA分子;14輪體內(nèi)篩選后，成功獲得了RNA解旋酶的核酸適配體。2013年，Cheng等[44]同樣利用體內(nèi)篩選的方法，獲得了能夠通過血腦屏障與腦毛細管內(nèi)皮細胞和實質(zhì)細胞結(jié)合的核酸適配體，這為藥物的腦靶向輸送提供了可能。在正常生理條件下，篩選獲得的核酸適配體能夠直接在體內(nèi)識別原位的潛在靶細胞，從而鑒別不同組織或抑制體內(nèi)靶細胞中特定的靶分子，這是體內(nèi)篩選的最大優(yōu)勢。理論上，體內(nèi)篩選更符合實際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，具有更廣闊的前景[45～46]。

4 結(jié)語與展望

SELEX技術(shù)自建立至今已有近30年的發(fā)展歷程，雖然篩選方式不斷得到改進，甚至出現(xiàn)了自動化的篩選方式，但是目前為止，尚未建立起一個標準化的篩選流程。SELEX篩選仍是現(xiàn)階段制約核酸適配體應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵，以全細胞為靶標的cell-SELEX技術(shù)為例，細胞表面分子的復(fù)雜性加劇了篩選的困難程度，并不是每次的篩選都能保證得到理想的核酸適配體。因此，開發(fā)更為高效且實用的cell-SELEX核酸適配體篩選方法是非常有必要的，這仍需廣大研究者的深入探索。相信在不久的未來，核酸適配體的篩選及應(yīng)用必將展示更大的潛能。