張音音，晏 俊，彭 俊，馮 浩，肖 軍*

(1.省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081)

脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)分為兩類:天然免疫與獲得性免疫。其中天然免疫又稱非特異性免疫，是宿主抵御病原微生物的第一道防線，同時(shí)也是魚類抗病的主要防御機(jī)制。天然免疫在脊椎動(dòng)物抵御外界不利條件如病毒和細(xì)菌類病原微生物的入侵時(shí)發(fā)揮著非常重要的作用[1～3]。天然免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識(shí)別保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-as sociated molecular patterns，PAMPs)，為宿主抵御微生物入侵提供關(guān)鍵的防御[4～7]。入侵病原體被PRRs識(shí)別后，通過下游信號(hào)通路誘導(dǎo)干擾素(interferon，IFN)和干擾素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)表達(dá)，進(jìn)而觸發(fā)天然免疫應(yīng)答。模式識(shí)別受體主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)、核苷酸寡聚域樣受體(nucleotide oligomerization domainlike receptors，NLRs)[8～9]。其中，RIG-Ⅰ樣受體是宿主細(xì)胞內(nèi)識(shí)別RNA病毒的核心受體，其介導(dǎo)的RLR抗病毒信號(hào)通路是宿主細(xì)胞識(shí)別RNA病毒并引發(fā)抗病毒天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，是目前魚類抗病毒研究的熱點(diǎn)[10]。RLR家族包括視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)、遺傳學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)，這3個(gè)RLR成員結(jié)構(gòu)相似，都具有中心的DExD/H-box解旋酶域和C端調(diào)控域(RD)[11]。此外，RIG-Ⅰ和MDA5的N端還具有2個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，在被病原分子激活后，可與線粒體上的線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)N端CARD 結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用[12～13]，激活MAVS并使其發(fā)生多聚化，進(jìn)而募集下游的干擾素基因刺激物(stimulator of interferon genes，STING)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factor，TRAF)家族成員(TRAF2、TRAF3和TRAF6)等接頭分子。TRAF家族成員蛋白繼續(xù)募集并誘導(dǎo)TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)、抑制性 κB 激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)α/β和γ等活化。這些激酶進(jìn)而活化核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子3/7(interferon regulatory factor 3/7，IRF3/7)，使其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活促炎癥因子與IFN的表達(dá)[14～16]。

TANK是在對(duì)TRAF2的相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，分離出的一種新的蛋白質(zhì)[17]。有研究報(bào)道，在哺乳動(dòng)物中過表達(dá)TRAF2時(shí)，TANK能激活NF-κB信號(hào)通路[18]，但亦有研究顯示TANK能負(fù)調(diào)控 TNF-α、IL-1 和 CD40介導(dǎo)的 NF-κB 活化[17]，這表明TANK蛋白對(duì)NF-κB通路的影響具有雙重作用。TBK1、TANK和TRAF2可以形成一個(gè)三元復(fù)合物，從而激活TBK1，活化的TBK1抑制TANK介導(dǎo)的NF-κB激活，但不阻斷由TNF-α、IL-1或CD40介導(dǎo)的激活[19]。此外，TANK還可以與RLRs信號(hào)通路中多個(gè)調(diào)控分子如MAVS、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapterinducing interferon-β，TRIF)、TRAF3 以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IRF3發(fā)生相互作用，調(diào)控IRF3的磷酸化并誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生[20]。最近的研究表明，LPS、poly(I:C)和病毒刺激可顯著增強(qiáng)青魚TANK(black carp TANK，bcTANK)誘導(dǎo)干擾素啟動(dòng)子的表達(dá)活性，并且在EPC細(xì)胞中過表達(dá)bcTANK能顯著增強(qiáng)其抗病毒能力，表明bcTANK在宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要作用[21]。但TANK在其他硬骨魚類中是否具有類似的功能，仍有待進(jìn)一步研究。

本文以模式動(dòng)物斑馬魚為研究對(duì)象，首次克隆并獲得了斑馬魚TANK(DrTANK)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)序列并對(duì)其功能進(jìn)行了初探，證實(shí)了DrTANK為一種胞質(zhì)蛋白，并且poly(I:C)和GCRV刺激可顯著增強(qiáng)DrTANK誘導(dǎo)干擾素啟動(dòng)子的表達(dá)活性，表明了DrTANK在斑馬魚抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要作用，為后續(xù)TANK在硬骨魚抗病毒天然免疫中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

本文中所用的斑馬魚(野生型，AB系)購(gòu)自于國(guó)家斑馬魚資源中心(武漢)，飼養(yǎng)在位于湖南師范大學(xué)校內(nèi)的“教育部多倍體魚繁殖與育種技術(shù)工程研究中心”。

1.2 儀器與試劑

PCR儀(Mastercycler nexus gradient，德國(guó) Eppendorf公司);高速冷凍離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf公司);電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠);轉(zhuǎn)膜儀(Trans-Blot SD Cell，美國(guó)Bio-Rad公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(371型，美國(guó)Thermo公司);倒置相差顯微鏡(DMI3000B，瑞士LEICA公司);激光共聚焦顯微鏡(FV1200，日本Olympus公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，美國(guó));抗Flag鼠單克隆抗體(Sigma公司，美國(guó));羊抗鼠IgG(Sigma公司，美國(guó));Alexa 488偶聯(lián)二抗(Invitrogen公司，美國(guó));poly(I:C)(sigma公司，美國(guó));雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒(Promega公司，美國(guó));胎牛血清(BI公司，以色列);Triton-x-100(BBI生命科學(xué)有限公司)等。

1.3 細(xì)胞和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)中所用到的HEK293T細(xì)胞(293T)、EPC(epithelioma papulosum cyprini)細(xì)胞和CIK(Ctenopharyngodon idella kidney)細(xì)胞均為實(shí)驗(yàn)室自有細(xì)胞[22]。所有的細(xì)胞系均用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、2 mmol/L 谷酰胺、100 mg/L 青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)。其中，HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱;EPC、CIK細(xì)胞培養(yǎng)在26℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

實(shí)驗(yàn)中所用到的質(zhì)粒pcDNA5/FRT/TO、pRLTK、Luci-DrIFNφ1、Luci-DrIFNφ3、Luci-eIFN[21]為實(shí)驗(yàn)室自有質(zhì)粒。DrTANK重組載體pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag是在克隆獲得DrTANK開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列后，通過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，將DrTANK編碼區(qū)序列插入到C端帶有Flag標(biāo)簽的pcDNA5/FRT/TO中獲得。

1.4 DrTANK編碼區(qū)的克隆及序列比對(duì)分析

采用Trizol法從斑馬魚的腎臟組織提取RNA后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，然后根據(jù)NCBI上已有的斑馬魚TANK預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物(表1)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)斑馬魚TANK的ORF進(jìn)行擴(kuò)增。將獲得的PCR產(chǎn)物連接到C端帶有Flag標(biāo)簽的pcDNA5/FRT/TO表達(dá)載體上，測(cè)序獲得DrTANK序列信息，并利用MEGA 6.0程序和GeneDoc程序?qū)rTANK與其他脊椎動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 病毒的生產(chǎn)及病毒滴度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中所用到的草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張永安教授饋贈(zèng)，病毒株型號(hào)為GCRV106。制備病毒時(shí)，將低感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的 GCRV 病毒加到用含有2%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞中，2～3 d后，收集含病毒的上清液儲(chǔ)存在-80℃冰箱。病毒滴度測(cè)定采用文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法，簡(jiǎn)要步驟如下:首先將收集的病毒上清液三凍三融，再將依次稀釋10倍(10-1～10-7)的病毒加到EPC細(xì)胞中，孵育2 h后用含有2%FBS和0.75%的甲基纖維素培養(yǎng)基換液，3 d后觀察并計(jì)數(shù)病毒斑，計(jì)算病毒滴度。

1.6 免疫印跡

將EPC細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞接種到6孔板中，每孔分別轉(zhuǎn)染3 000 ng的pcDNA5/FRT/TODrTANK-Flag，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等量的pcDNA5/FRT/TO質(zhì)粒，48 h后收集細(xì)胞，3 000 r/min離心3 min，去上清液，加入等體積的PBS(phosphate buffered saline)和 2× SDS loading buffer，沸水中煮 20 min。用10%SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解液;恒壓半濕法轉(zhuǎn)膜;5%的脫脂牛奶封閉1～2 h;隨后加一抗(抗Flag的鼠單克隆抗體，1︰3 000)4℃孵育過夜，TBST(Tris-buffered saline and Tween-20)清洗 4遍，每次8 min;再加二抗(羊抗鼠IgG，1︰30 000)室溫孵育1 h，TBST清洗4遍，每次8 min;最后用堿性磷酸酶顯色。

1.7 免疫熒光

將EPC細(xì)胞接種到24孔板中，每孔轉(zhuǎn)染500 ng的 pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag。24 h后，吸去上清，PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗;0.2%Triton-x-100穿透 15 min，PBS清洗;10%FBS(PBS+胎牛血清)封閉1 h，PBS清洗;加一抗(抗Flag的鼠單克隆抗體，1︰300)孵育1 h，PBS清洗6遍，每次8 min;加二抗(Alexa 488偶聯(lián)二抗，1︰1 000)孵育1 h，PBS清洗6遍，每次8 min;封片。晾干后利用激光共聚焦顯微鏡拍照，也可置于-20℃避光環(huán)境下保存數(shù)天后拍照。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的EPC細(xì)胞接種在24孔板中，待細(xì)胞到達(dá)80%左右密度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在檢測(cè)DrTANK能否誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)中，共轉(zhuǎn) pRL-TK(25 ng)、Luci-DrIFNφ1/Luci-DrIFNφ3(250 ng)、空載體或 pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng);在檢測(cè)poly(I:C)或者GCRV刺激是否會(huì)影響DrTANK誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生能力的實(shí)驗(yàn)中，共轉(zhuǎn)pRL-TK(25 ng)、Luci-DrIFNφ1(250 ng)、空載體或 pcDNA5/FRT/TO-Dr-TANK-Flag(50/100/200 ng)，并用濃度為50 mg/L的 poly(I:C)或者 MOI為 0.1的 GCRV處理 2 h。每個(gè)孔轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭繛?75 ng，當(dāng)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒質(zhì)量不足475 ng時(shí)，則用空載體補(bǔ)足到475 ng。轉(zhuǎn)染24 h后，用細(xì)胞裂解液(passive lysis buffer，PLB)裂解細(xì)胞，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光素酶活性。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used in PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果和病毒滴度測(cè)量結(jié)果中的所有數(shù)據(jù)均來自3個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。誤差線表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)(*)代表P＜0.05。數(shù)據(jù)分析采用雙尾t檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 DrTANK基因的克隆和序列分析

為了探究DrTANK在斑馬魚天然免疫中的功能，我們從斑馬魚的腎臟組織中克隆出了其TANK CDS區(qū)序列(NCBI序列號(hào):MK715455)。結(jié)果顯示，DrTANK CDS由1 047個(gè)核苷酸組成，編碼349個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量為39.27 kD，等電點(diǎn)為5.64(http://web.expasy.org/protparam/)。為了研究TANK的進(jìn)化關(guān)系，將DrTANK氨基酸序列與人、小鼠和火雞的TANK氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DrTANK N端的氨基酸序列相對(duì)保守(圖1)。同時(shí)，從選定的物種中系統(tǒng)分析TANK氨基酸序列的同源性(圖2)，結(jié)果顯示DrTANK與青魚TANK的氨基酸相似性最高，表明這兩個(gè)物種在進(jìn)化上的遺傳關(guān)系較近 (74.9%，表2)。

2.2 DrTANK蛋白的表達(dá)

為后續(xù)研究DrTANK的功能，我們構(gòu)建了DrTANK表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染到HEK293T和EPC細(xì)胞中，觀察DrTANK蛋白的表達(dá)(以β-actin作為內(nèi)參)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和魚類細(xì)胞中，pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag均能正確表達(dá)DrTANK蛋白(圖3)。

2.3 DrTANK在細(xì)胞內(nèi)的定位

在之前的研究中，我們已經(jīng)證實(shí)了青魚的TANK為胞質(zhì)蛋白[21]。為了檢測(cè)DrTANK在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，我們?cè)贓PC細(xì)胞中過表達(dá)Dr-TANK后進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)DrTANK表達(dá)區(qū)域(綠色)包圍細(xì)胞核(藍(lán)色)(圖 4)，表明 Dr-TANK也是一種胞質(zhì)蛋白。

圖1 DrTANK的同源比對(duì)利用MEGA 6.0程序和GeneDoc程序?qū)唏R魚與其他脊椎動(dòng)物的TANK氨基酸序列進(jìn)行比較，圖片中顏色深淺代表同源性強(qiáng)弱，顏色越深表示該位點(diǎn)同源性越高。Fig.1 Homology comparison of the DrTANKThe DrTANK amino acid sequence was compared with those of other vertebrate TANKs by using MEGA 6.0 program and Gene-Doc program.The shades in the picture represent the homology between different species，the darker the color，the higher the homology of this locus.

圖2 DrTANK的進(jìn)化分析利用MEGA 6.0軟件將DrTANK與不同物種的TANK進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。這些物種包括Cynoglossus semilaevis(XP_008-326921)、Paralichthys olivaceus(NW_017859656.1)、Larimichthys crocea(XP_010730520)、Oryzias latipes(XP_004081941)、Xiphophorus maculatus(XP_005805397)、Boleophthalmus pectinirostris(XP_020784622)、Scleropages formosus(XP_018597007)、Ictalurus punctatus(XP_017325567)、Mylopharyngodon piceus(MG462752)、Meleagris gallopavo(XP_010711971)、Python bivittatus(XP_007427628)、Homo sapiens(NP_004171)、Mus musculus(NP_035659)。Fig.2 Evolution analysis of the zerbrafish TANKBy using MEGA 6.0 software，the amino acid sequence of the zerbrafish TANK was aligned with those of TANKs from different species，including(GenBank accession number)Cynoglossus semilaevis(XP_008326921)，Paralichthys olivaceus(NW_0178-59656.1)，Larimichthys crocea(XP_010730520)，Oryzias latipes(XP_004081941)，Xiphophorus maculatus(XP_005805397)，Boleophthalmus pectinirostris(XP_020784622)，Scleropages formosus(XP_018597007)，Ictalurus punctatus(XP_017325567)，Mylopharyngodon piceus(MG462752)，Meleagris gallopavo(XP_010711971)，Python bivittatus(XP_007427628)，Homo sapiens(NP_004171)，Mus musculus(NP_035659).

表2 DrTANK與其他脊椎動(dòng)物TANK的比較(%)Table 2 Comparison of the DrTANK with other vertebrate TANKs(%)

2.4 DrTANK對(duì)干擾素的誘導(dǎo)活性

為研究DrTANK在干擾素產(chǎn)生過程中的作用，我們?cè)贓PC細(xì)胞中過表達(dá)DrTANK，并用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析DrTANK是否能誘導(dǎo)斑馬魚干擾素啟動(dòng)子1/3(DrIFNφ1/3)的表達(dá)。結(jié)果顯示，在EPC細(xì)胞中過表達(dá)斑馬魚TANK不上調(diào)或者僅能微弱上調(diào)DrIFNφ1/3啟動(dòng)子表達(dá)活性(圖5A，B)。當(dāng)用ploy(I:C)和GCRV刺激上述過表達(dá)DrTANK的EPC細(xì)胞時(shí)，DrIFNφ1雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在上述刺激下，DrTANK誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的能力明顯增強(qiáng)(圖5C，D)，這些結(jié)果表明DrTANK在斑馬魚抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要作用。

3 討論

圖3 DrTANK蛋白的表達(dá)分析(A)EPC細(xì)胞中的免疫印跡分析;(B)HEK293T細(xì)胞中的免疫印跡分析。Ctr:轉(zhuǎn)染空載體的EPC細(xì)胞或HEK293T細(xì)胞，Dr-TANK-Flag:轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag表達(dá)載體的細(xì)胞。Fig.3 Protein expression of DrTANK(A)Immunoblot assay of EPC cells;(B)Immunoblot assay of HEK293T cells.Ctr:EPC cells or HEK293T cells transfected with empty vector;DrTANK-Flag:Cells transfected with pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag.

圖4 DrTANK蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位EPC細(xì)胞免疫熒光染色。(A)視野中綠色區(qū)域是DrTANK蛋白表達(dá)區(qū)域;(B)視野中藍(lán)色區(qū)域是細(xì)胞核所在區(qū)域;(C)A圖與B圖的融合;(D)C圖方框圈定區(qū)域的放大圖。TANK-Flag:pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag。Fig.4 Intracellular localization of DrTANKImmunofluorescence staining of EPC cells.(A)The green represents the expression region of DrTANK;(B)The blue represents the region where the nucleus is located;(C)The fusion of A and B;(D)A larger view of the area boxed in Figure C.TANK-Flag:pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag.

斑馬魚(Danio rerio)是一種重要的模式動(dòng)物，其作為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育和造血的模型已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究。近年來，斑馬魚亦被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域。受精后，由于斑馬魚適應(yīng)性免疫系統(tǒng)需要4～6周后才能在形態(tài)和功能上成熟，所以其幼苗中僅存在天然免疫系統(tǒng)，這為脊椎動(dòng)物天然免疫研究提供了良好的模型[24]。天然免疫是保障機(jī)體不受外來病原體入侵的一道重要防線，當(dāng)病原體入侵時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。Ⅰ型干擾素被很多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3、NF-κB和ATF-1-c-Jun等[25]。TRAF家族蛋白 (TRAF1～TRAF7)在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、NF-κB和凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用[26]，TANK可以抑制依賴于不同TRAF信號(hào)傳導(dǎo)的TBK1非依賴性途徑(例如TNF-α和IL-1)，并且可以以TBK1依賴性方式與TRAF2、5和6協(xié)同激活NF-κB[27]。TANK與MCPIP1/USP10形成的復(fù)合物能介導(dǎo)TRAF6的去泛素化，并負(fù)向調(diào)控由于DNA損傷誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[28]。在TLRs的信號(hào)通路中，TANK能與TBK1和IKKε相互作用，磷酸化IRF3/7和上調(diào)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[29]。當(dāng)用EMCV 3C蛋白酶裂解TANK時(shí)，TANK-TBK1-IKKε-IRF3復(fù)合體被破壞，從而抑制IRF3的磷酸化和干擾素的表達(dá)[30]。以上信息說明TANK在誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)過程中具有重要作用。

目前，魚類中有關(guān)TANK功能研究的報(bào)道僅限于青魚[21]。該研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、聚肌胞苷酸[poly(I:C)]、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)和草魚呼腸孤病毒(GCRV)刺激均可以上調(diào)青魚細(xì)胞中TANK基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)LPS、poly(I:C)和GCRV刺激可顯著增強(qiáng)青魚TANK激活干擾素的能力;另外在EPC細(xì)胞中過表達(dá)青魚TANK可顯著增強(qiáng)其抗病毒能力，該研究首次在硬骨魚中報(bào)道了bc-TANK在宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要作用。但在其他硬骨魚中，TANK在天然免疫反應(yīng)中的功能有待進(jìn)一步研究。

在本文中，我們以模式動(dòng)物斑馬魚為研究對(duì)象，對(duì)其TANK基因進(jìn)行了克隆及功能初探。結(jié)果顯示，TANK在陸生動(dòng)物和水生動(dòng)物中的同源性較低，推測(cè)可能與TANK在不同物種中的功能多樣性有關(guān)。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，DrTANK蛋白遷移約為50 kD，大于Expasy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)的值，我們猜想DrTANK可能在表達(dá)過程中發(fā)生了蛋白質(zhì)修飾，比如磷酸化或SUMO化[29，31]。為了進(jìn)一步闡明病毒感染介導(dǎo)的DrTANK基因誘導(dǎo)IFN的機(jī)制，我們對(duì)其在天然免疫抗病毒RLRs通路中的作用進(jìn)行了探索。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)DrTANK本身并不能誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，但是在病原(細(xì)菌或病毒)刺激下其誘導(dǎo)Ⅰ型IFN表達(dá)的能力增強(qiáng)，這與之前青魚中的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)樵谕饨绲拇碳は?，TANK會(huì)與體內(nèi)的TBK1、IKKε和TRAF家族成員相互作用，誘導(dǎo)了干擾素的表達(dá)?？偟膩碇v，本研究為證明TANK在硬骨魚天然免疫中具有重要的功能提供了佐證，同時(shí)也為之后驗(yàn)證TANK在先天性免疫途徑的作用，以及能否參與到其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的研究奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，有關(guān)DrTANK誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

圖5 DrTANK誘導(dǎo)干擾素啟動(dòng)子表達(dá)的能力(A)在EPC細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)pRL-TK、Luci-DrIFNφ1、空載體或 pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定不同劑量DrTANK誘導(dǎo)DrIFNφ1啟動(dòng)子表達(dá)的能力;(B)在EPC細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)pRL-TK、Luci-DrIFNφ3、空載體或pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定DrTANK誘導(dǎo)DrIFNφ3啟動(dòng)子表達(dá)的能力;(C)將pRL-TK、Luci-DrIFNφ1、空載體或pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)共同轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，并用濃度為50 mg/L的poly(I:C)處理2 h，24 h后用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定poly(I:C)刺激后DrTANK誘導(dǎo)DrIFNφ1啟動(dòng)子表達(dá)的能力;(D)將pRL-TK、Luci-DrIFNφ1、空載體或pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)共同轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，并用MOI=0.1的GCRV處理2 h，24 h后用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定GCRV刺激后DrTANK誘導(dǎo)DrIFNφ1啟動(dòng)子表達(dá)的能力。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。誤差線上方的數(shù)字代表IFN相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性。Fig.5 IFN-inducing activity of DrTANK(A)In EPC cells，pRL-TK，Luci-DrIFNφ1，an empty vector or pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)were co-transfected and assayed using the dual luciferase reporter system to test the promoter activity of DrIFNφ1 induced by DrTANK;(B)In EPC cells，pRL-TK，Luci-DrIFNφ3，an empty vector or pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)were co-transfected and assayed using the dual luciferase reporter system to test the promoter activity of DrIFNφ3 induced by DrTANK;(C)EPC cells were co-transfected with pRL-TK，Luci-DrIFNφ1，an empty vector or pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag (50/100/200 ng)and treated with poly(I:C)at a concentration of 50 mg/L for 2 h.After 24 h，the promoter activity of DrIFNφ1 induced by DrTANK after poly(I:C)stimulation was assayed by the dual luciferase reporter system;(D)EPC cells were co-transfected with pRL-TK，Luci-DrIFNφ1，an empty vector or pcDNA5/FRT/TO-DrTANK-Flag(50/100/200 ng)and infected with GCRV at the MOI of 0.1 for 2 h.After 24 h，the promoter activity of DrIFNφ1 induced by DrTANK after GCRV infection was assayed by the dual luciferase reporter system.Error bars indicate standard deviation and data from 3 independent replicates.The number above the error bar represents IFN relative transcription activity.