岳樹盛，史 艷，向紅群，王 珩，朱澤曙，丁浩東，范雄偉，吳秀山，李 芳，莫小陽

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心，中國湖南長(zhǎng)沙410081)

先天性心臟病，簡(jiǎn)稱先心病，是臨床胎兒心血管發(fā)育異常、心功能不全而導(dǎo)致胎兒心臟或大血管畸形，甚至死亡的一類先天性疾病[1]。先心病發(fā)病率占新生兒的1%～2%，而患病嬰兒的死亡率超過29%，因此先心病是影響兒童身心健康、家庭生活質(zhì)量以及國家人口素質(zhì)的重大科學(xué)和社會(huì)問題[2]。目前認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素及其相互作用是先心病發(fā)生的主要原因[3]。現(xiàn)階段，遺傳因素導(dǎo)致先心病的分子機(jī)制已取得一定的進(jìn)展[4～5]，但環(huán)境因素致先心病的分子機(jī)制尚不明確。

誘發(fā)先心病的環(huán)境因素復(fù)雜多樣，孕期宮內(nèi)病毒感染、藥物、化學(xué)污染、不良生活習(xí)慣及母體疾病(如高血壓)等都會(huì)導(dǎo)致先心病的發(fā)生[6～10]。賴杰等[11]報(bào)道，1990—2000年重慶市先心病患兒與流感發(fā)病數(shù)呈正相關(guān)，且母體感染流感病毒與先天性心臟病(如室間隔缺損等)的發(fā)生相關(guān)[12～14]。人類胚胎心臟發(fā)育的第2～8周是先心病發(fā)生的重大風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期，孕母體早期感染流感病毒后，胎兒出現(xiàn)心血管畸形的概率顯著增加[15]。但流感病毒引發(fā)先心病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，探究流感病毒致先心病發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)先心病預(yù)防和治療具有重要的理論及臨床意義。

為研究流感病毒對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的影響，我們以SPF級(jí)F344大鼠品系為材料，建立了穩(wěn)定的流感病毒H1N1感染的大鼠模型。隨后，通過熒光定量PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR)，檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的8個(gè)與心臟發(fā)育相關(guān)的基因(BMP4、FGF12、WWOX、NRG1、SHOX2、BCL2、DDR2 和 EPHB3)[16～24]在感染流感病毒的心臟組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，BMP4、FGF12、WWOX、DDR2 和 EPHB3 基因的表達(dá)降低。本文可為探究流感病毒導(dǎo)致先心病發(fā)生的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)先心病的預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 病毒

本實(shí)驗(yàn)所用到的病毒株為流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，由湖南師范大學(xué)分子病毒實(shí)驗(yàn)室提供，密封保存于-80℃。用噬斑形成單位(plaque forming unit，PFU)法測(cè)定流感病毒滴度后按最適劑量攻毒。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)F344大鼠品系，三月齡，購自北京維通麗華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在湖南師范大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房操作。

1.1.3 試劑和實(shí)驗(yàn)材料

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，異丙醇、無水乙醇均購自湖南匯虹試劑有限公司。熒光定量384孔反應(yīng)板購自ABI生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的懷孕檢測(cè)

前一晚上8點(diǎn)，將大鼠按照雌雄1︰1的比例合籠，每12 h進(jìn)行雌鼠陰道涂片檢測(cè)，觀察到雄鼠精子即為胚胎0.5 d。

1.2.2 大鼠攻毒及取材

在鼠胚胎心臟發(fā)育的初始階段，即胚胎發(fā)育8.5 d(E8.5 d)時(shí)采用滴鼻法攻毒，攻毒地點(diǎn)在湖南師范大學(xué)動(dòng)物房攻毒專用房間，大鼠孕鼠攻毒劑量為0.553×104PFU。取大鼠E13.5 d時(shí)期胚胎以及胚胎心臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè);取大鼠E11.5 d時(shí)期胚胎心臟保存于-80℃冰箱待RNA提取。此外，取大鼠E11.5 d時(shí)期的胚胎，統(tǒng)計(jì)每次解剖的胚胎數(shù)量，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的各孕母鼠樣本數(shù)量均不少于3只。

1.2.3 熒光定量PCR

取大鼠胚胎11.5 d心臟組織，用TRIZOL裂解細(xì)胞，采用氯仿、異戊醇萃取RNA，隨后用75%乙醇洗去雜質(zhì)，再用RNA-Free water溶解。按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書的詳細(xì)步驟，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫。以得到的cDNA文庫作為模板，按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TaKaRa)說明書配制反應(yīng)體系(表1)，在Quanstudio 5(Ther-mo Fisher)儀器上按照標(biāo)準(zhǔn)的兩步法運(yùn)行Q-PCR。將正常樣本用Ct值均一化(以 β-ACTIN作為管家基因進(jìn)行校正)后，按照2-△△Ct法計(jì)算基因在攻毒樣本中的表達(dá)量。文中所用到的引物序列詳見表2。

表1 qRT-PCR各組分體積表Table 1 The component volumes in qRT-PCR

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 流感病毒影響大鼠的胚胎發(fā)育

我們首先建立大鼠宮內(nèi)感染流感病毒H1N1的模型，觀察胚胎11.5 d、13.5 d的發(fā)育狀況。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，感染流感病毒后，胚胎都出現(xiàn)了發(fā)育滯緩現(xiàn)象(圖1)。胚胎11.5 d時(shí)，尾部較長(zhǎng)，頸部外曲圓小，耳和眼睛發(fā)育較遲(圖1 B);胚胎13.5 d時(shí)，體形瘦小，四肢較短，后肢尤為明顯，尾部稍長(zhǎng)且鼻上頜未完全閉鎖，腦部液體充盈，全身動(dòng)脈血管發(fā)育不全，軟骨化程度低，體內(nèi)脂肪含量低導(dǎo)致整體較為通透，尤其是頭、頸部(圖1D)。此外，感染流感病毒后，大鼠的胚胎死亡率約為20%，且孕鼠均有流產(chǎn)跡象，表現(xiàn)為死胎增多，流產(chǎn)率加重(圖1G)。以上結(jié)果說明，H1N1流感病毒感染大鼠孕鼠后，胚胎的發(fā)育受到抑制，甚至?xí)斐膳咛サ幕位蛄鳟a(chǎn)。

2.2 流感病毒影響大鼠胚胎的心臟發(fā)育

實(shí)驗(yàn)室前期研究表明流感病毒導(dǎo)致小鼠胚胎心臟的發(fā)育缺陷(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。在本研究中，我們利用流感病毒感染的大鼠模型，探究流感病毒是否影響大鼠胚胎的心臟發(fā)育。結(jié)果顯示，與正常組相比，攻毒孕鼠E13.5 d時(shí)期的胚胎心臟表現(xiàn)出左、右心房充血擴(kuò)張，左、右心室縮小，右室流出道未完全向左傾斜，主動(dòng)脈根部膨出等癥狀(圖2)。這些與孕小鼠感染病毒后胚胎早期發(fā)育心臟的表型一致。以上結(jié)果表明H1N1流感病毒感染大鼠孕鼠可能影響其胚胎的心臟發(fā)育，導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育畸形。

表2 特異性qRT-PCR檢測(cè)引物Table 2 Primers for specific qRT-PCR detection

圖1 大鼠宮內(nèi)感染流感病毒后的胚胎表型分析A，B:正常大鼠和攻毒大鼠E11.5 d胚胎形態(tài)圖(白色箭頭所指的是頸部外曲圓);C～F:正常大鼠和攻毒大鼠E13.5 d胚胎形態(tài)圖(白色五角星指的是鼻上頜)，E和F分別是C、D白色五角星處的放大圖;G:大鼠在正常和攻毒條件下所取胚胎數(shù)量圖，0表示孕鼠胚胎全部死亡。Control表示正常對(duì)照組;H1N1表示流感病毒感染組;數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差呈現(xiàn);**，P＜0.01;標(biāo)尺=2 mm。Fig.1 The embryonic phenotype analysis of rats infected with influenza virus in uteroA and B:E11.5 d embryo morphology image of normal rats and influenza virus infected rats(white arrows refer to the outer curve of the neck);C～F:E13.5 d embryo morphology of normal and influenza virus infected rats(white pentagram refers to the upper maxilla).E and F are magnified views of white pentagram positions in C and D，respectively;G:The number of embryos taken under normal and influenza virus infected conditions in rats，and 0 indicates the total death of pregnant rat embryos.“Control”means the normal control group，and “H1N1” means influenza virus infection group.Data are shown as mean±standard error(±sx).**:P＜0.01;scale bar=2 mm.

2.3 流感病毒對(duì)大鼠胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因的影響

實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了流感病毒NS1蛋白融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞系(H9C2)后進(jìn)行了ChIPSeq分析，篩選出了8個(gè)與大鼠心臟發(fā)育相關(guān)的基因:BMP4、FGF12、WWOX、DDR2、EPHB3、NRG1、SHOX2和BCL2(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。為了進(jìn)一步研究流感病毒導(dǎo)致大鼠胚胎心臟發(fā)育異常的分子機(jī)制，我們利用qRT-PCR檢測(cè)篩選出的基因在病毒感染后大鼠胚胎心臟中的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在H1N1流感病毒感染后的大鼠胚胎心臟組織中顯著下調(diào)的基因有 BMP4(表達(dá)下調(diào) 85.5%，P=0.000 54)、FGF12(表達(dá)下調(diào) 89.0%，P=0.000 31)、WWOX(表達(dá)下調(diào)93.0%，P=0.000 16)、DDR2(表達(dá)下調(diào) 89.4%，P=0.017)、EPHB3(表達(dá)下調(diào) 76.0%，P=0.049);而NRG1(P=0.07)、SHOX2(P=0.42)和 BCL2(P=0.19)的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(圖3)。以上結(jié)果表明，BMP4、FGF12、WWOX、DDR2、EPHB3 基因的表達(dá)下調(diào)可能是流感病毒引起先心病發(fā)生的重要分子途徑。但是具體的分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步闡明。

3 討論

先天性心臟病是最常見的新生兒缺陷，研究先心病的發(fā)病機(jī)制對(duì)先心病的預(yù)防和治療具有極為重要的意義[25]。目前，環(huán)境因素與先心病的分子機(jī)制研究甚少。在流感病毒大爆發(fā)時(shí)期，先心病的發(fā)病率驟然升高，孕母體流產(chǎn)甚至死亡等臨床病癥高度增加[26]。因此，揭示流感病毒導(dǎo)致先心病的發(fā)病機(jī)理對(duì)了解先心病的發(fā)生和預(yù)防具有重要意義。

圖2 大鼠E13.5 d時(shí)期胚胎心臟表型Control，正常大鼠胚胎心臟;H1N1，宮內(nèi)感染流感病毒的胚胎心臟。RA:右心房;RV:右心室;LA:左心房;LV:左心室。Fig.2 E13.5 d embryonic cardiac phenotype“Control” means the heart of normal rats，and “ H1N1” means the heart of H1N1 infections.RA:Right atrial;RV:Right ventricle;LA:Left atrial;LV:Left ventricle.

圖3 流感病毒對(duì)大鼠胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)表示，采用 Student’s t-test進(jìn)行顯著性分析。 ***，P＜0.001;*，P＜0.05;NS，P＞0.05。Fig.3 Relative expression of genes involved in the fetal heart development of rats infected with influenza virusData are analysed by Student’s t-test and shown as mean±standard error(±s).***，P＜0.001;*，P＜0.05;NS，P＞0.05.

心臟發(fā)育的信號(hào)調(diào)控是復(fù)雜的，單基因的表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)紊亂，從而導(dǎo)致先心病的發(fā)生。本研究建立了F344大鼠流感病毒宮內(nèi)感染模型，發(fā)現(xiàn)流感病毒影響大鼠胚胎和胚胎心臟的發(fā)育，造成胚胎發(fā)育遲緩、體積減小、心臟發(fā)育畸形以及流產(chǎn)等現(xiàn)象。其中心臟發(fā)育表型畸形包括流出道縮短和膨出、心房充血擴(kuò)張和心室縮小，但心臟內(nèi)部的結(jié)構(gòu)缺陷仍需進(jìn)一步探究。BMP4、FGF12、WWOX、DDR2和 EPHB3基因的正常表達(dá)對(duì)胚胎心臟的發(fā)育至關(guān)重要。BMP4是一種心肌細(xì)胞標(biāo)記因子，直接參與調(diào)控房室墊以及房室間隔的形成。敲除小鼠BMP4基因后，會(huì)導(dǎo)致房室管缺損，引發(fā)先天性心臟病，胚胎在發(fā)育到中期之前即出現(xiàn)死亡[16]。FGF12與Na+通道的相互作用在引起心律失常中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)GF12的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致心室心動(dòng)過速[17]。WWOX基因高度保守，WWOX敲除小鼠同樣存在發(fā)育遲緩，并且骨結(jié)構(gòu)發(fā)育異常;出生后18 d，小鼠骨體積和皮質(zhì)厚度減少，在3周內(nèi)全部死亡[18]。大鼠WWOX基因突變后，會(huì)導(dǎo)致侏儒癥并伴有癲癇癥狀[19]。DDR2在心臟早期的心外膜及內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在心尖和房室墊的局部區(qū)域表達(dá)增加[23]。EPHB3在胚胎血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，對(duì)于胚胎心臟以及胚胎血管系統(tǒng)的生成和重塑至關(guān)重要[24]。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在感染流感病毒的大鼠胚胎心臟中，這些基因都發(fā)生顯著性下調(diào)，可能是引起大鼠胚胎心臟發(fā)育畸形的重要原因之一，其潛在的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文通過形態(tài)學(xué)觀察和熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染大鼠孕鼠后，影響其胚胎、胚胎心臟及發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，這為以后流感病毒致先心病研究提供了理論基礎(chǔ)。但是，本文的研究在大鼠中仍不夠完善，H1N1流感病毒具體調(diào)控心臟發(fā)育異常的信號(hào)機(jī)制仍需后續(xù)研究。