李 興，馬麗娜，彭大為，王美清

直腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，手術配合放療、化療等輔助手段的綜合治療方式是目前公認的直腸癌治療原則，尤其直腸癌術前給予新輔助放化療已成為共識，對提高病人遠期生存率具有積極意義[1]。腫瘤的生長、浸潤、轉移及復發(fā)均與腫瘤細胞的增殖及血管形成密切相關，大量臨床研究[2]證實新輔助放化療可調節(jié)腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達，是改善胃癌、乳腺癌及宮頸癌病人預后的可能機制之一。但新輔助放化療對直腸癌病人MVD、PCNA及VEGF的表達及其預后的影響鮮見報道。本研究通過免疫組織化學技術，檢測新輔助放化療前后直腸癌病人標本中MVD、PCNA及VEGF表達變化，并探討其與臨床預后的關系，旨在為直腸癌新輔助放化療的臨床應用提供參考?，F作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010-2012年我院收治的直腸癌并接受新輔助放化療病人96例為觀察組，入組病人均經結腸鏡檢查及活檢組織病理檢查確診為直腸癌；選擇同期僅行手術切除的直腸癌病人86例為對照組；2組病人性別、年齡、病理分期、UICC臨床分期和手術方式等差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。

1.2 治療方法 對照組僅行直腸癌根治性手術。觀察組病人采用術前新輔助放化療：術前采用6 MVX線直線加速器進行常規(guī)分割放療每次1.8 Gy，每周5次，總劑量45～50 Gy；于放療同步卡培他濱(上海羅氏制藥有限公司)，825 mg/m2，每天2次，每周第1～5天口服化療，放療結束停止。新輔助放化療結束后4～6周進行直腸癌根治性手術。

表1 2組病人一般資料比較

1.3 觀察指標 (1)觀察組取行新輔助放化療前后手術切除標本進行MVD、PCNA及VEGF表達檢測；(2)對照組取手術前病檢標本及手術切除標本進行MVD、PCNA及VEGF表達檢測；(3)記錄3年隨訪統(tǒng)計復發(fā)率。

1.4 檢測方法 所取病理標本采用免疫組織化學SP法進行染色，切片脫蠟，加入3%過氧化氫封閉阻斷內源性過氧化物酶，50 μL非免疫動物血清封閉，加50 μL PCNA及VEGF單克隆抗體分別進行PCNA及VEGF標記，一抗過夜，50 μL生物素標記第二抗體，辣根過氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木精復染，中性樹膠固封。MVD采用CD34單克隆抗體標記后計數(抗體均購于Abcam公司)。

1.5 判定標準[3]PCNA及VEGF染色陽性分別以細胞核或血管內皮細胞中出現棕黃色顆粒為標準，并均以陽性細胞數量進行分級，陰性(-)：無陽性細胞；低度表達(+)：陽性細胞數<25%；中度表達(2+)：陽性細胞數25%～50%；高度表達(3+)：陽性細胞數>50%。-及 +視為陰性，2+及3+視為陽性。光鏡下選擇5個血管密度最高區(qū)域進行MVD測定，分別對每個區(qū)域中被染成棕黃色的血管數目進行計數，5個區(qū)域血管數目平均值為MVD最終數值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗和χ2檢驗。

2 結果

2.1 2組病人手術前后MVD、PCNA及VEGF變化 2組病人手術前MVD、PCNA及VEGF差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；手術后觀察組病人MVD和PCN陽性表達率顯著降低(P<0.01)，與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；2組病人VEGF差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2 )。

表2 2組病人手術前后及VEGF變化[n；百分率(%)]

2.2 2組病人術后復發(fā)率比較 術后隨訪3年，對照組86例病人中，8例復發(fā)，復發(fā)率為9.3%；觀察組96例病人中，2例復發(fā)，復發(fā)率為2.1%，2組復發(fā)率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.27，P>0.05)。

3 討論

直腸癌是最常見消化道惡性腫瘤之一。近年來，隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，國內外直腸癌發(fā)病率及死亡率均呈逐年上升趨勢，嚴重威脅病人的生命健康[4]。手術切除是治療直腸癌的主要方法，盡管手術規(guī)范程度和操作技巧均有較大提高，但僅行手術治療遠期預后往往較差，病人5年生存率僅為50%左右，局部復發(fā)和遠處轉移是導致手術治療失敗的最主要因素[5]。

新輔助放化療與傳統(tǒng)術后放化療相比較，具有諸多優(yōu)點：(1)可于術前實現腫瘤“降體積”“降期”，使部分病人達到病理學完全緩解，進而提高手術根治切除率；(2)降低腫瘤切緣陽性率，從而減少術后腫瘤原位復發(fā)率；(3)提高低位直腸癌病人保肛率；(4)為手術創(chuàng)造機會或減少術后復發(fā)，減小毒性反應及手術吻合口放射性損傷[6-8]。目前，新輔助放化療已被廣泛應用于結直腸癌的輔助治療，并成為綜合治療中的一項重要手段。胡俊杰等[9]等通過回顧分析新輔助放化療后行腹腔鏡手術的56例直腸癌病人臨床資料(觀察組)及直接行腹腔鏡術的147例直腸癌病人臨床資料(對照組)發(fā)現，觀察組和對照組中轉開腹率、手術時間、術中出血量、術后排氣時間及術后住院時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示新輔助放化療后行腹腔鏡直腸癌手術具有良好的安全性，并不會增加手術難度；觀察組和對照組淋巴結檢出數目分別為12.32枚和15.47枚，提示新輔助放化療可實現腫瘤降期目的，是術前放化療敏感的表現。PCNA是DNA聚合酶的重要輔助蛋白，是反映腫瘤細胞增殖的標志物之一；MVD是反映腫瘤血管形成程度的標志；VEGF在腫瘤血管形成過程中起到至關重要的作用，其表達水平與PCNA及MVD呈正相關[9-12]。

本研究結果證實，觀察組術后MVD、PCNA表達顯著降低，而對照組術后MVD、PCNA表達無明顯變化，提示新輔助放化療可顯著降低MVD、PCNA。其可能因為經新輔助放化療后，腫瘤組織變性、壞死，繼而導致瘤體縮小，為維持腫瘤組織績效生長而激發(fā)VEGF的表達。觀察組病人3年內復發(fā)率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，2組中復發(fā)者MVD、PCNA及VEGF表達均顯著高于未復發(fā)者，提示腫瘤的復發(fā)與腫瘤新生血管密切相關，行新輔助放化療可有效改善直腸癌病人預后，其誘導MVD、PCNA低表達可能是降低直腸癌病人術后復發(fā)率的重要原因。而本研究中觀察組復發(fā)率雖低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，有待于擴大樣本進一步證實。

綜上所述，MVD、PCNA可成為判斷直腸癌預后的重要指標。新輔助放化療可以降低直腸癌病人MVD及PCNA表達。